Рудольф Самусев - Общая и частная гистология

Рудольф Павлович Самусев, Марина Юрьевна Капитонова

Общая и частная гистология

Предисловие

В настоящем пособии в краткой форме изложены сведения по общей и частной гистологии в соответствии с учебной программой по гистологии, цитологии и эмбриологии. Материал иллюстрирован снимками с оригинальных гистологических препаратов, а также электронограммами.

С позиций современной морфологической науки даны основные понятия по цитологии, типам тканей, приведены особенности микроскопического строения органов и систем человеческого организма.

Пособие может быть использовано для повторения материала при подготовке к занятиям, зачетам и экзамену по дисциплине.

Для студентов медицинского и биологического профилей высших учебных заведений, а также для молодых ученых-морфологов.

Список сокращений

АДГ – антидиуретический гормон

АКТГ – адренокортикотрогшый гормон

АТФ – аденозинтрифосфат

ГМК – гладко-мышечные клетки

ГМТ – гладкая мышечная ткань

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

ДЭС – диффузная эндокринная система

КЦ – клеточный цикл

КЯП – комплекс ядерной поры

ЛГ – лютеинизирующий гормон

ОП – окаймленный пузырек

ПНС – периферическая нервная система

иРНК – информационная рибонуклеиновая кислота

рРНК – рибосомная рибонуклеиновая кислота

тРНК – транспортная рибонуклеиновая кислота

РТК – рецепторные Т-клетки

СКК – стволовые кроветворные клетки

ТТГ – тиреотропный гормон

ТЭМ – трансмиссионная электронная микроскопия

ФК – фузогенный комплекс

ФСГ – фолликулостимулирующий гормон

ЦНС – центральная нервная система

ЭПС – эндоплазматическая сеть

Глава 1

Гистологическая техника

Гистология, как и любая другая наука, имеет свои задачи и специфические методы исследования материала. Основным методом является изучение фиксированных и окрашенных гистологических препаратов под микроскопом в проходящем свете.

Традиционный способ подготовки материала для получения гистологического препарата включает следующее: 1) фиксацию материала; 2) промывку фиксированного материала; 3) обезвоживание и уплотнение материала; 4) приготовление блоков; 5) изготовление срезов (резка); 6) окрашивание срезов; 7) заключение и маркировку срезов.

1.1. Фиксация материала

Цель фиксации – максимально закрепить и сохранить в обрабатываемой ткани или органе его прижизненную структуру. После фиксации материал разрезают или расщепляют, чтобы получить срезы толщиной 5—20 мкм. Затем полученные срезы окрашивают или обрабатывают соответствующими способами для приготовления постоянных гистологических препаратов, способных сохраняться длительное время.

Фиксатор (фиксирующая жидкость) должен обладать следующими качествами: быстро проникать в ткани и коагулировать белки исследуемого материала – ткани или органа для исключения аутолиза; сводить до минимума деформацию (сморщивание или набухание) объекта; легко удаляться при промывке водой и не мешать дальнейшей обработке (уплотнению и окрашиванию) изучаемого материала.

Количество фиксатора по объему должно быть, как правило, в 100 раз больше объема фиксируемого материала. Используют фиксатор только один раз. Величина фиксируемого кусочка должна быть минимальной – не более 1 см3 или 1 см в одном измерении, а в особых случаях не превышать 1 мм3.

Продолжительность фиксации – не менее 24 ч, при других методиках и экспресс-диагностике – от 3–5 мин до 6 ч. Большие колебания времени фиксации зависят от применяемых методик, специфики материала и фиксатора.

Из наиболее распространенных фиксаторов чаще всего применяют следующие:

1) формалин (10–20 % водный раствор);

2) этиловый спирт (этанол) 80–96 %;

3) смесь спирта с формалином (спирт-формол): 70 % этилового спирта 10 мл и 10–20 % раствора формалина 4 мл;

4) жидкость Мюллера: калия двухромовокислого 2,5 г, натрия сульфата 1 г, воды 100 мл;

5) жидкость Ценкера: жидкости Мюллера 100 мл, сулемы 5 г, ледяной уксусной кислоты (добавляют сразу перед употреблением фиксатора) 5 мл;

6) жидкость Максимова (ценкер-формол): жидкости Ценкера 90 мл, формалина 10–20 % 10 мл.

1.2. Промывка фиксированного материала

Промывка материала (кусочки органов, тканей или небольшие органы целиком, особенно от мелких экспериментальных животных) в водопроводной проточной воде, как правило, продолжается столько же, сколько длилась фиксация, чаще 18–24 ч. Затем фиксированные ткани и органы должны быть подготовлены для получения срезов различного типа: целлоидиновых, парафиновых или замороженных.

1.3. Обезвоживание и уплотнение фиксированного материала

Этот этап необходим в случаях, если нужно получить целлоидиновые или парафиновые блоки. Перед заливкой материала в целлоидин или парафин из изучаемых объектов удаляют воду и уплотняют их. Для этого материал последовательно переносят в спирты возрастающей крепости, начиная с 70 % до абсолютного (100 %) включительно, т. е. проводят через батарею спиртов возрастающей крепости. Время пребывания в каждом спирте колеблется в зависимости от характера ткани от 4–6 до 24 ч.

1.4. Приготовление блоков

Целлоидиновые блоки. Материал из абсолютного спирта перекладывают в две порции (на 24 ч в каждую) смеси из равных количеств абсолютного спирта и эфира. Затем кусочки тканей последовательно помещают от 2 до 7 дней в растворы целлоидина: I (2 %), II (4 %), III (8 %), IV (8 %). Последний целлоидиновый раствор вместе с помещенными в него кусочками ткани подсушивают в эксикаторе наполовину, т. е. до получения 16 % раствора.

На поверхность целлоидина наливают 70 % спирт и через 1 сут вырезают из уплотненной массы кусочки материала, отступя от их краев на 3–5 мм, и с помощью густого раствора целлоидина наклеивают на деревянные кубики, предварительно обезжиренные спиртом или эфиром.

Целлоидиновые блоки до изготовления из них срезов хранят в 70 % этиловом спирте в банках с притертой пробкой.

Парафиновые блоки. Производят такие же обезвоживание и уплотнение изучаемого объекта, как и при целлоидиновой заливке, т. е. проводку через батарею спиртов возрастающей крепости. После этого кусочки перемещают в смесь равных частей абсолютного спирта и ксилола на 1–3 ч (или спирта и хлороформа на 6—12 ч), затем последовательно переносят в первый чистый ксилол на 1–3 ч (или хлороформ на 6—12 ч), во второй чистый ксилол на 1–3 ч (или хлороформ на 6—12 ч), насыщенный раствор парафина в ксилоле в термостате при температуре 37 °C на 2 ч (или хлороформе на 6—12 ч). Для этих целей применяется легкоплавкий парафин.

Далее кусочки тканей переносят в термостате в «чистый» тугоплавкий парафин при температуре 54–57 °C на 1,5–2 ч, во второй «чистый» парафин при той же температуре и на такой же срок. Наконец, материал (по объектам, органам или тканям) заливают расплавленным парафином в бумажные или металлические формочки и охлаждают водой низкой температуры в холодильнике, охлаждающих термосах, криостате и т. д. Эта процедура преследует определенную цель – равномерное затвердевание парафина и находящихся в нем тканей при постепенном снижении температуры скрепляющего субстрата.

Каждый из залитых в парафин комплексов в дальнейшем прикрепляют к деревянным кубикам, обработанным по той же методике, что и для целлоидиновых блоков, путем скрепления нижней, расплавленной прикосновением нагретого шпателя поверхности препарата с верхней поверхностью деревянного кубика.

Хранят парафиновые блоки в сухих банках с притертой пробкой в прохладных и недоступных солнечным лучам местах или шкафах, удаленных от нагревательных приборов и аппаратуры.

Необходимый блок извлекают непосредственно перед приготовлением срезов, а его остатки, если это необходимо для дальнейшего исследования, сразу после изготовления нужного количества срезов помещают в прежнее хранилище.

1.5. Изготовление срезов

Ткань, которую необходимо подвергнуть микроскопическому исследованию, режут на срезы на специальных аппаратах, получивших название микротомов (санные или роторные), с помощью особых стальных ножей.

Наиболее распространенным из них является санный микротом (рис. 1.1). Этот аппарат состоит из массивной металлической подставки – основания с вертикальной и боковой, расположенной под острым углом пластинами с хорошо отшлифованными полосками – полозьями, по которым скользят в горизонтальном положении ножевые салазки с отшлифованными поверхностями – ножедержатель. На каждой поверхности имеется специальный паз с винтом для крепления микротомного ножа из прочной стали, заточку лезвия которого производят под контролем микроскопа.

С помощью винта можно регулировать наклон ножа к горизонтальной плоскости, а за счет барашкового зажима – угол поворота ножа, что позволяет наиболее удобно ориентировать его к блоку и приготовлять оптимально тонкие срезы.