Коллектив авторов - Общая вирусология с основами таксономии вирусов позвоночных Страница 13

Уровни сегментации: гены, мРНК и белки. Разделение эукариотических клеток на ядерные и эндоплазматические компартменты глубоко влияет на биологию вирусов. Рибосомы эукариот требуют метилированной кэп-структуры на 5’-конце мРНК, которая играет критическую роль в передаче сигналов инициирования белкового синтеза. В результате, эукариоты подчиняются правилу – «одна мРНК – одна полипептидная цепь», и, за немногими исключениями, каждая мРНК функционирует как отдельная единица трансляции. РНК-зависимые РНК-полимеразы вирусов обладают ограниченной способностью к взаимодействию с внутренними инициирующими сайтами РНК-матриц, что создает проблему получения нескольких индивидуальных белков на основе единственного генома. В процессе эволюции различные семейства РНК-содержащих вирусов нашли три решения этой проблемы: фрагментация на уровне белков, образование субгеномных мРНК, сегментация генома. Например, РНК-вирусы семейств Picorna-, Toga-, Flavi– и Retroviridae для того, чтобы получить функциональные белковые продукты используют протеолитическое расщепление полипротеина-предшественника. Вирусы других семейств – Сorona-, Аrteri-, Rhabdo-, Paramyxoviridae – зависят от сложных механизмов транскрипции и чтобы произвести несколько различных моноцистронных мРНК с единственной РНК- матрицы вынуждены синтезировать субгеномные мРНК. Представители семейств Reo-, Orthomyxo-, Bunya-, Arenaviridae и др. решили проблему, фрагментируя геномы. При этом вирионы содержат многократные доли генома, каждый из которых часто представлен единственным геном. У вирусов растений такие доли РНК генома могут пакетироваться в отдельные вирионы (явление мультипартитности), требуя инфекции несколькими вирусными частицами для обеспечения инвазивной способности вируса, в то время, как сегменты генома вирусов животных обычно пакетированы совместно. Напротив, ДНК вирусы редко используют или сегментацию генома или синтез полипротеина. Это вероятно связано с относительной простотой синтеза моноцистронных мРНК, которая может быть транскрибирована с внутренних промоторов на двунитевой ДНК и подвергнута альтернативному сплайсингу, подобно ядерным транскриптам клетки.

Каждая разновидность РНК-генома имеет свои стратегии репликации, экспрессии генов и упаковки в вирионы.

Одно- и двунитевые РНК-геномы вирусов. Хотя все РНК-геномы реплицируются обычным способом комплементарного спаривания нуклеотидных оснований матрицы и дочерней нити, различные семейства РНК-содержащих вирусов реализуют различные молекулярные стратегии репликативного цикла РНК и ее инкапсидации. Семейства однонитевых РНК-вирусов превосходят численностью семейства вирусов с двунитевой РНК геномом почти в 10 раз.

Чтобы ограничить накопление промежуточных репликативных форм, содержащих области двунитевых РНК, вирусы разработали стратегии, различающиеся у (+)РНК и (-)РНК. Все (+)РНК-содержащие вирусы синтезируют непропорционально низкие уровни негативных нитей – от 1 % до 5 % от уровня положительной РНК и таким образом минимизируют потенциал для накопления двунитевой РНК. Наоборот, (-)РНК-вирусы нуждаются в существенных количествах (+)РНК нитей, чтобы использовать их в качестве матрицы для синтеза геномного потомства. Обычно ()РНК-вирусы предотвращают отжиг (+) и (-) нитей, сохраняя геномную РНК в составе нуклеокапсида.

(+)РНК и (-)РНК геномы. Различия между положительным и отрицательным РНК-геномами определяются полярностью нитей, инкапсидированных в вирионы. (+)РНК-геном в начале инфекции использует синтезированные на рибосомах вирусоспецифические белки и клеточные РНК-связывающие белки. После того, как синтезированные вирусоспецифическая РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp) и другие неструктурные белки покидают рибосомы, начинается репликация РНК. Затем вновь синтезированные структурные белки вириона и РНК ассемблируют с образованием вирусного потомства. В противовес этому, (-)РНК-геномы и их антигеномные комплементы остаются связанными с белками нуклеокапсида, как в пределах вирусных частиц, так и в течение всего цикла вирусной репликации. Эти фундаментальные адаптационные различия основаны на том, что геномы положительной полярности должны удовлетворять трансляционным критериям, которые диктуются клеткой-хозяином, в то время как негативные геномы и антигеномы должны удовлетворять только матричным требованиям вирусоспецифической RdRp, в связи с тем, что они копируются, но никогда не транслируются. Хотя до настоящего времени остается неясным, как полимераза может копировать покрытые белком РНК-матрицы. днРНК-геномы являются промежуточными между этими крайностями: родительские доли генома остаются изолированными в субвирусных частицах на протяжении всего инфекционного цикла.

Однако следует учитывать, что положительные нити-предшественники двунитевого РНК потомства изначально не инкапсидированы. Вероятно, эти вариации отражают существенные различия в структурах вирусных комплексов RdRp-матрицах и в молекулярных механизмах репликации положительных, отрицательных и двунитевых РНК-геномов.

Линейные и кольцевые РНК-геномы. Репликация РНК не только требует сохранения приемлемого уровня ошибок, как обсуждено ранее, но также должна избегать систематических делеций или вставок нуклеотидов. Особенно подвержены изменениям концевые последовательности геномов, дублирование которых представляет проблему.

При репликации ДНК проблема терминации синтеза усилена тем, что ДНКполимераза не может начать синтез дочерней нити de novo, для чего требуется наличие затравки. Это создает дополнительные сложности, связанные с копированием праймер-связывающей последовательности. Одним из нескольких известных, наиболее экономичных и широко распространенных в природе решений этой проблемы является устранение концов путем образования кольцевой ДНК, как в прокариотических геномах. В отличие от ДНК-полимераз, большинство РНК-полимераз не требует затравок, так что РНК-геномы менее восприимчивы к проблеме концов. Соответственно, большинство РНК-геномов вирусов – линейные молекулы. Ковалентно замкнутые кольцевые РНК найдены только у вируса гепатита дельта животных, среди вироидов и некоторых других субвирусных РНК-патогенов, которые инфицируют растения. Однако концы линейных рибонуклеиновых кислот особенно чувствительны к деградации и их репликация особенно склонна к ошибкам. Следовательно, каждое семейство РНК-вирусов имеет особенности, разработанные для сохранения концов генома. Например, множество РНК-геномов положительной полярности несут 5’-кэп и 3’-поли-A трек, которые защищают от деградации концы последовательности эукариотических мРНК. Подобную роль, вероятно, выполняет геномный белок (Vpg), который ковалентно связан к 5’-концом РНК пикорнавирусов, а также устойчивые вторичные структуры РНК, найденные на 3’-конце РНК флавивирусов и в других геномах. 3’-концы многих рибонуклеиновых кислот вирусов растений формируют структуры типа «кленового листа», которые подобны клеточным тРНК. Кроме этого, в (+)РНК вирусов обнаружены модификации, которые могут служить для соединения ее концов. Эти модификации опосредуют взаимодействие 3’-конца с клеточными белками типа поли-A-связывающего белка и кэп-связывающего комплекса, что приводит к формированию нековалентно замкнутых функциональных комплексов, которые могут повторно промотировать трансляцию рибосомами и повторно реплицироваться RdRp's. В отличие от (+)РНК-геномов вирусов, негативные – и амбисенс РНК-геномы редко несут ковалентные концевые модификации. Эти рибонуклеиновые кислоты обычно обладают некоторой степенью комплементарности концевой последовательности, которая, как думают, стабилизирует вирусный нуклеокапсид и промотирует репликацию РНК, возможно, делая матрицу функционально кольцевой, как описано для рибонуклеиновых кислот положительной полярности. Концевая комплементарность последовательности также позволяет концам РНК выступать в роли теломеров и служить 5’-концевой матрицей для восстановления разрушенных 3’-концевых нуклеотидов. Другое решение проблемы концов имеется у некоторых (+/-)РНК-содержащих аренавирусов. Эти вирусы устойчивы к концевым изменениям и способны допустить существенный уровень вариабельности концевых последовательностей генома, возможно, располагая необходимыми внутренними cisacting сигналами, далеко отстоящими от концов РНК. Ретровирусные геномы наоборот избыточны, и имеют прямые повторы между 12 и 235 нуклеотидами на каждом конце. Эти прямые повторы поддерживают и восстанавливают целостность концов РНК в течение обратной транскрипции и вирусной репликации. Сегментированные и несегментированные РНК-геномы. Сегментация генома вирусов облегчает производство индивидуальных продуктов в эукариотических клетках. В тоже время это означает, что каждая доля генома для обеспечения экспрессии, репликации и 28 сборки вирионов должна содержать соответствующие регуляторные cis-acting сигналы. В некоторых семействах вирусов с сегментированным геномом (Orthomyxoviridae, Reоviridae) эти сигналы включают консервативные для всех сегментов концевые последовательности, но у вирусов других семейств (бипартитные Noda- и Tetraviridae), существенных консервативных последовательностей у разных долей генома не выявлено.