Ирина Спивак - Экология. Повреждение и репарация ДНК: учебное пособие Страница 4

Все виды экзонуклеазной коррекции должны закончиться за время данной репликации. По-видимому, коррекция ДНК-полимеразных ошибок – весьма эффективный процесс, поскольку анализ генома человека показал, что дивергенция последовательностей в транскрибируемой ДНК составляет примерно 0,1 % при исследовании ДНК от 24 человек различных этнических групп.

2. Типы повреждений ДНК

Большинство повреждений ДНК не являются результатом только ошибок репликации. Множество повреждений возникает в любое время клеточного цикла под действием как экзогенных, так и эндогенных факторов. В табл. 1. схематично изображены основные типы повреждений ДНК, которые опознаются и устраняются различными системами репарации.

Ультрафиолетовые лучи вызывают образование пиримидиновых димеров, 6,4-фотопродуктов, аддуктов, разрывов и прочие повреждения ДНК. Под действием химических агентов происходят разного рода модификвции нуклеотидов, возникают межнитевые сшивки, конформационные дефекты. Двунитевые разрывы могут приводить к перестройкам хромосом, что и является главной причиной летального действия ионизирующей радиации.

Таблица 1. Основные типы повреждений ДНК.

В результате внутриклеточных процессов в ДНК образуются многочисленные АP-сайты из-за спонтанной утраты пуринов/пиримидинов, окисленные участки (например, 8-оксигуанин), возникающие под действием токсических радикалов, постоянно генерируемых в процессах метаболизма.

Следует заметить, что все повреждения показаны только схематически, так как любое из них вызывает локальное изменение структуры ДНК вокруг, а разрывы ДНК почти всегда сопровождаются и модификацией прилежащих к ним оснований. Кроме обычно упоминаемых пиримидиновых димеров, под действием УФ облучения образуются и другие повреждения, например, 6,4-фотопродукты. В дальнейшем, описывая различные системы репарации ДНК, мы будем подробно останавливаться на тех типах повреждений, которые они способны исправлять.

3. Многообразие систем репарации ДНК

Системы репарации ДНК крайне разнообразны – от простых одноэтапных (фотореактивация, деалкилирование) до сложнейших, многоэтапных механизмов, контролируемых большим числом генов и, включающих соответственно, большое число белков. Этим репарация принципиально отличается от процессов репликации и рекомбинации, обходящихся существенно более ограниченным набором биохимических реакций. Множественность частично перекрывающихся и дополняющих друг друга систем репарации, даже некоторая их избыточность, повышает надежность защиты генома и расширяет возможности обеспечения его работы в онтогенезе и при различных физиологических условиях. Классификация процессов репарации ДНК строится на тех реакциях, которые являются их основой. Выделяются реакции прямой репарации, системы эксцизионной репарации ДНК, репарация с привлечением рекомбинации, пострепликативная репарация, репарация двунитевых разрывов, репаративный обход повреждения, причем иногда один и тот же тип репарации может иметь несколько разных названий. В результате исследований последних лет эта классификация менялась и уточнялась, что мы в дальнейшем будем учитывать.

4. Прямая репарация ДНК

Самый простой и эффективный путь восстановления поврежденных нуклеотидов в составе ДНК – это прямое обращение тех химических реакций, индуцированных химическими или физическими агентами, результатом которых стало данное повреждение. Такой способ устранения повреждений принято называть прямой репарацией. К сожалению, с помощью реакций этого типа может быть исправлено только ограниченное число повреждений. Реакциями прямой репарации являются фотореактивация, репарация с помощью метилтрансфераз (репарация алкилированного гуанина), прямая вставка пуринов инсертазой и прямое зашивание однонитевых разрывов полинуклеотидлигазой.

4.1. Фотореактивация

Фотореактивация – первый из описанных (еще до появления модели ДНК Уотсона и Крика) процессов репарации, поэтому на истории его открытия мы подробно остановимся. Намек на то, что живые клетки способны выживать после действия летальной дозы УФ облучения появляются в научном сообществе чуть раньше середины 1930-годов. Разразившаяся Вторая мировая война задержала открытия этого механизма ДНК-репарации повреждений, возникающих в результате УФ облучения до конца 1940-х, до независимых одновременных наблюдений Альберта Кельнера (эмигранта из Германии), работавшего в группе Милислава Демерека в лаборатории Колд-Спринг-Харбора, и Ренато Дальбекко из лаборатории Сальватора Лурии в университете Индианы. В 1949 году немецкий генетик Альберт Кельнер, бежавший из гитлеровской Германии в США, обнаружил, что в клетках бактерий и грибов, таких, как стрептомицеты и пенициллы, облученных ультрафиолетовым (УФ) светом, а затем перенесенных на видимый свет, частота мутаций падает, а выживаемость резко возрастает по сравнению с клетками, оставленными после облучения в темноте. Кельнер пришел к выводу, что на свету проходят реакции восстановления и какие-то поврежденные молекулы или части их возвращаются к норме. Нужно подчеркнуть, что в 1949 году большинство генетиков еще не понимали ведущей роли ДНК в наследственности, имели весьма смутные представления о структуре хромосом и даже не знали, что дрожжи и другие грибы являются эукариотами. Поэтому объяснение, данное Кельнером восстановлению повреждений на свету, было по-настоящему пионерским. Макс Дельбрюк, другой эмигрант из Германии, будущий Нобелевский лауреат, подсказал Кельнеру название для описанного им явления – фотореактивация. В том же 1949 году сходный процесс был найден независимо Р. Дальбекко у бактериофагов. Ни Кельнер, ни Дальбекко не занимались изучением повреждений ДНК или их репарацией. Они оба использовали УФ-облучение как экспериментальный инструмент и заметили неожиданно высокие уровни выживаемости, когда клетки или бактериофаги (вирусы бактерий) после УФ-облучения в результате лабораторной ошибки во время их исследований в соответствующих лабораториях оказались на свету. Их старания объяснить эти поразительные наблюдения привели к открытию феномена фотореактивациии, когда полученные при облучении УФ-светом ДНК-повреждения репарируются в реакции со светозависимым ферментом.

Кельнер считается первооткрывателем фотореактивации потому, что именно он пришел к выводу, что за процесс исправления ответственна простая реакция в наследственном аппарате. Этот вывод был сделан еще до постулирования существования ДНК в виде двойных спиралей и признания за ДНК функции наследственных молекул.

В этой истории есть еще одно забавное совпадение. Как раз в то самое время, когда Дальбекко наткнулся на фотореактивацию, Уотсон был аспирантом в той же самой лаборатории Лурии и сам в своем диссертационном исследовании занимался эффектами ионизирующей радиации. Удивительно, что всего через 4 года при открытии Уотсоном и Криком структуры ДНК, ни Дальбекко, ни сам Уотсон даже не подумали о репарации ДНК.

Процесс фотореактивации состоит в том, что тиминовые димеры, возникшие в результате УФ-облучения, разрушаются, и тимины возвращаются к своей исходной форме под действием видимого света. Что же такое представляет собой пиримилиновый димер? В 1960 году голландские ученые Р. Бьюкерс и У. Верендс изучили химию процесса повреждения нуклеиновых кислот УФ-светом и выделили продукт, специфический для данного повреждающего агента. Оказалось, что двойная связь между пятым и шестым атомами углерода в составе пиримидиновых оснований (тимине и питозине в ДНК и цитозине и урациле в РНК) под действием УФ-света может рваться. Атомы остаются связанными одиночной связью, а в результате разрыва другой связи образуются две свободные валентности.

Рисунок 2. Схема фотореактивации

Обычно ДНК в клетках находятся в так называемой В-форме, когда плоскости оснований параллельны друг другу и расстояние между плоскостями равно примерно 3,4 А. Это расстояние оказывается как раз таким, чтобы освободившиеся при УФ-облучении валентности между С5=С6 атомами пиримидпновых оснований, расположенных рядом в цепи ДНК, могли замкнуться друг на друга и сформировать более сложное, так называемое циклобутановое кольцо. Если димеризация произошла в РНК, то могут возникнуть димеры урацила и любого другого пиримидинового основания. Довольно часто употребляют и другой термин для их обозначении – пиримидиновые димеры. В зависимости от того, какие основания соединены в димер, их называют димерами тимина, димерами цитозина или тимин-цитозиновыми димерами.

Сущность процесса фотореактивации, изображенного на рис. 2, заключается в том, что фермент фотолиаза расщепляет вновь образовавшиеся связи между соседними основаниями и восстанавливает нативную структуру ДНК. В 1963 году фотолиаза E. coli была выделена и очищена. Этот белок кодируется геном phr, а линии с мутациями гена phr имеют дефекты световой репарации.