Коллектив авторов - Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии Страница 5

В последнее время большой популярностью пользуется метод выявления комплекса «антиген – антитело», подобный непрямой иммуногистохимической реакции, в которой роль вторичных антител, связанных с ферментной меткой, выполняет сложный молекулярный комплекс. Он состоит из осевой структуры, образованной небольшой молекулой полимера, к которой присоединены вторичные антитела (иммуноглобулины или их Fab-фрагменты) и маркерный фермент. Благодаря достаточно большому числу молекул фермента, находящихся в составе подобного комплекса, увеличивается чувствительность реакции. Использование вторичных реагентов, созданных на основе такой «полимерной» технологии позволяет не только повысить чувствительность метода в сравнении с методами ABC и LSAB, но и устранить вероятность неспецифической реакции с эндогенным биотином, который может присутствовать в части исследуемых тканей.

Близкой к «полимерным» системам разновидностью систем амплификации являются мультимерные системы (пример – наборы REVEAL, Spring Bioscience). Их преимущество перед «полимерными» реагентами состоит в малых размерах конъюгата, за счет чего обеспечивается лучшее проникновение вторичных антител к местам связывания первичных. При этом должна увеличиться и чувствительность реакции.

Нередко при постановке иммуногистохимических реакций даже с использованием высокочувствительных систем детекции связавшихся первичных антител исследователь сталкивается с проблемой недостаточной иммунореактивности, которую не удается решить, используя более высокие концентрации антител и увеличивая продолжительность инкубации. Методы демаскирования антигена – один из подходов, который позволяет существенно увеличить чувствительность реакции (см. гл. 5). Кроме него возможно применение и других приемов.

В тех случаях, когда продукт реакции отчетливо определяется в окрашенных препаратах, но желательно добиться его большей оптической плотности и контрастности, можно использовать метод тонирования DAB-продукта солями никеля или кобальта (Mullink H. [et al.], 1992). В ряду коммерческих наборов, предназначенных для выявления пероксидазы бензидиновой реакцией, имеются и такие, в которых реализована возможность никелевого тонирования. Применение солей никеля ведет к усилению интенсивности гистохимической реакции на пероксидазу и меняет цвет продукта реакции: он становится не желто-коричневым, а черным.

Усиления реакции можно достичь, проводя реакцию с мечеными вторичными антителами в сочетании с дополнительной реакцией с другими мечеными вторичными антителами, выработанными против иммуноглобулинов животного происхождения – источника первых вторичных антител. Такой подход позволяет увеличить концентрацию маркерного фермента (либо флуорохрома) в месте локализации продукта «антиген – антитело».

Наибольшего увеличения чувствительности реакции можно добиться, используя наборы, усиливающие реакцию при помощи тирамида (Bobrow M. N. [et al.], 1989; 1992). Применение конъюгатов тирамида в ИГХ основано на способности тирамида, при каталитическом влиянии пероксидазы, образовывать нерастворимое соединение в локусе действия фермента. Тирамид может быть помечен как флуорохромом, так и биотином, что дает возможность использования тирамидной амплификации не только при проведении флуоресцентной микроскопии, но и при обычной микроскопии в проходящем свете.

Таким образом, в настоящее время для исследователя доступен широкий спектр методов визуализации продукта иммуногистохимической реакции. Выбор конкретного способа должен определяться с учетом задачи исследования, предполагаемой концентрации антигена в изучаемом материале и наличия соответствующей приборной базы.

Литература

Bobrow M. N., Harris T. D., Shaughnessy K. J. [et al.]. Catalyzed reporter deposition: A novel method of signal amplification: Application to immunoassays // Journal of Immunological Methods. – 1989. – Vol. 125. – P. 279 – 285.

Bobrow M. N., Litt G. J., Shaughnessy K. J. [et al.]. The use of catalyzed reporter deposition as a means of signal amplification in a variety of formats // Journal of Immunological Methods. – 1992. – Vol. 150, № 1 – 2. – P. 145 – 149.

Mullink H., Vos W., Jiwa M., Horstman A. [et al.]. Application and comparison of silver intensification methods for the diaminobenzidine and diaminobenzidine-nickel endproduct of the peroxidation reaction in immunohistochemistry and in situ hybridization // J. Histochem. Cytochem. – 1992. – Vol. 40, № 4. – P. 495 – 504.

Глава 4.

ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

При взятии материала для ИГХ-исследования следует строго соблюдать все требования, которые предъявляются к этой процедуре при обычном патоморфологическом исследовании. Материал не должен подсыхать перед погружением в фиксирующую среду, его не следует промывать гипотоническими средами (например, водой). Фрагменты материала не должны быть слишком крупными, поскольку большие размеры фиксируемых кусочков не позволяют добиться равномерности фиксации и хорошей сохранности центральных областей объекта, что в последующем проявляется различными артефактами. Фрагменты тонкостенных полых органов и пленочные препараты необходимо фиксировать в расправленном состоянии. Лучше всего для этого использовать восковые пластины. Фрагменты картона и плотной бумаги менее пригодны. При планировании исследования костной ткани следует ограничиться минимальными размерами объекта, поскольку крупные фрагменты костной ткани невозможно хорошо декальцинировать в тех декальцинаторах, которые пригодны для ИГХ (см. Приложение 1).

Патогистологический материал, включая операционные биопсии, желательно фиксировать в нейтральном формалине (параформальдегиде) или цинк-формалине, который по времени фиксации и обеспечению способности препаратов к восприятию обзорных окрасок полностью подобен обычному формалину. Простой (не нейтрализованный) формалин, приготовленный из концентрированного формальдегида 1: 9, использовать нежелательно.

В научных исследованиях, когда требуются максимально высокое качество гистологического препарата и хорошая сохранность антигенов, следует помимо цинк-формалина использовать и другие фиксаторы, предназначенные для применения в ИГХ (см. Приложение 1). При проведении экспериментальных исследований в отдельных случаях может понадобиться перфузионная фиксация (способ, когда фиксирующая жидкость вводится через артериальное русло). Обычно после применения альдегидных фиксаторов наступает перекрестная сшивка белковых молекул, что ведет к ухудшению выявляемости антигенов и вызывает необходимость их протеолитического или теплового демаскирования. Наш опыт показывает, что применение «мягкой» фиксации (фиксация в этанол-формальдегиде при концентрации последнего 0,5 – 1,0 % в течение 12 – 24 ч и фиксация в цинк-этанол-формальдегиде до 24 ч) не приводит к существенному ослаблению иммуноцитохимической реакции на белки промежуточных филаментов, α-актин, коллаген IV типа, ламинин, фибронектин (Коржевский Д. Э. [и др.], 2001), белки PCNA (Коржевский Д. Э., 2000), Bcl-2 (Коржевский Д. Э. [и др.], 2002), CD31 (Коржевский Д. Э. [и др.], 2006б), CD68 (Коржевский Д. Э., 2001), ядерный белок NeuN (Коржевский Д. Э. [и др.], 2005) и не требует демаскирования антигена.

Коагулирующие фиксаторы (спирты и различные спиртовые композиции) дают лучшие результаты при фиксации белков и гликопротеидов с большой молекулярной массой. Так, оптимальной фиксацией для определения виментина является жидкость Карнуа (один из коагулирующих фиксаторов). При фиксации нервной ткани предпочтительна непродолжительная (до 24 ч) фиксация в цинк-этанол-формальдегиде (Коржевский Д. Э. [и др.], 2006а), который не только хорошо сохраняет многие антигены, но и дает возможность получить отличные результаты при окраске по Нисслю. Для фиксации небольших пептидов (инсулина и др.), малых молекул и гаптенов (например, моноаминов) рекомендуется использовать альдегидные фиксаторы, поскольку в коагулирующих фиксирующих средах возможно частичное растворение либо диффузия низкомолекулярных антигенов.

После окончания фиксации остатки фиксирующих веществ необходимо удалить из материала, тщательно промыв его в дистиллированной воде (после формалина и цинк-формалина) или этаноле (после коагулирующих фиксаторов и спиртовых смесей). Заливка должна быть осуществлена в течение 2 – 5 сут после завершения фиксации. Это обеспечивает максимальную сохранность антигенов и их хорошую выявляемость в препаратах. При использовании архивного материала, длительно фиксировавшегося в формальдегидных фиксаторах либо хранившегося в 80 % этаноле, тепловое демаскирование следует проводить обязательно для всех типов антигенов, которые при этом не подвергаются разрушению, и использовать вторичные системы детекции высокой чувствительности.

Степень «жесткости» альдегидной фиксации и пригодность архивного материала для ИГХ-исследования удобно контролировать, используя тест-реакцию с моноклональными антителами к виметину (клон V9). Антитела клона V9 выявляют чувствительный к перефиксации эпитоп этого белка ПФ. Поскольку клетки, содержащие виментин (фибробласты, эндотелиоциты, менингоциты и др.), присутствуют в любом гистологическом объекте, за редким исключением, отрицательные результаты пробной ИГХ-реакции на виментин будут указывать на малую пригодность материала для ИГХ в целом. При обезвоживании материала не следует применять изопропанол, который делает объекты хрупкими и плохо поддающимися резке на микротоме. В качестве промежуточных сред могут быть использованы: хлороформ, петролейный эфир, ортоксилол, метилсалицилат, метилбензоат, неоптическое кедровое масло, пихтовое масло, терпинеол. Заливку можно проводить, используя парафин любых коммерческих марок, лучше известных производителей, как отечественных, так и зарубежных. При этом не следует применять парафин с высокой температурой плавления (58 – 60 °C). При заливке не рекомендуется использовать температуры выше 60 °C.