Алексей Сизенцов - Антибиотики и химиотерапевтические препараты Страница 10

Иной подход должен быть при решении второй задачи – поисков продуцентов новых антибиотиков, активных в отношении определенных организмов. В данном случае продуценты антибиотических веществ следует пытаться выделить из всех групп организмов.

Изолированные штаммы изучаются в отношении их антибиотического действия к тем тест-организмам, для которых необходимо найти антибиотик.

При необходимости поиска среди микроорганизмов штамма, подавляющего развитие, например дрожжеподобного организма Candida albicans, в качестве тест-микроба используют С.albicatis или другой организм, близкий к нему по физиологическим свойствам.

Выделяя микроб-антагонист, активный по отношению к какому-либо возбудителю болезней растений, в качестве тест-организма необходимо использовать данный фитопатогенный организм. В этих случаях испытывают все выделяемые штаммы микроорганизмов, с тем, чтобы не пропустить организм, необходимый для решения поставленной задачи.

Гораздо сложнее обстоит дело с поиском продуцентов антибиотиков, активных в отношении вирусов и злокачественных новообразований. Так если бактерии, актиномицеты, грибы или протозоа – возбудители тех или иных заболеваний – могут быть непосредственно использованы в опытах как тесторганизмы при культивировании их на обычных лабораторных средах, то вирусы как внутриклеточные паразиты не могут культивироваться на таких средах. Для их развития нужны живые клетки, живые ткани. Аналогичные трудности возникают и при поисках противораковых антибиотиков. Рассмотрению этих вопросов посвящены последующие разделы.

Итак, первая задача исследователей при поиске продуцентов антибиотиков – выделение их из природных источников. Для этих целей широко применяется метод изменения генома выделенного продуцента антибиотика путем мутагенеза и генной инженерии. Наконец, для получения наиболее эффективного по биологическому действию антибиотика используют метод химической или биологической трансформации природных соединений.

3.1 Выделение микроорганизмов-антогонистов

Для выделения микроорганизмов – продуцентов антибиотиков из естественных мест их обитания применяется большое число разнообразных методов. В этом разделе мы остановимся лишь на самой общей характеристике этих методов.

В основу большинства приемов положен принцип выделения чистой культуры микроба и непосредственного испытания его по отношению к используемым тест-организмам. Однако существенное значение при образовании антибиотических веществ имеют и смешанные культуры. Это обстоятельство также необходимо помнить при поиске продуцентов антибиотических веществ.

Важное значение при выделении микроба-антагониста из той или иной группы организмов имеет специфичность условий его культивирования. Выделение микробов-продуцентов антибиотических веществ производят из субстратов, где обильно развиваются разнообразные формы микроорганизмов (бактерии, актиномицеты, дрожжи, грибы), поэтому очень важно знать и учитывать специфику условий развития тех организмов, которые необходимо выделить.

Например, большинство сапрофитных бактерий хорошо развивается на богатых по составу натуральных средах (мясопептонный агар, картофельный агар, сусло-агар и др.) при рН около 7,0 и температуре в пределах от + 30 °C до 37 °C. При этих условиях развиваются также актиномицеты и некоторые грибы, но для них такие условия менее благоприятны, чем для бактерий.

При выделении актиномицетов или грибов следует также учитывать особенности их развития. Актиномицеты растут медленнее, чем бактерии, они могут использовать такие источники питания, которые не очень хорошо используются бактериями.

Учитывая особенности развития актиномицетов, для выделения их из естественных субстратов рекомендуются следующие среды:

При этом рН сред устанавливается в пределах 6,8-7,1 после их стерилизации.

Для выделения термофильных актиномицетов удобно использовать среду следующего состава: агар – 15 г, пептон – 5 г, кукурузный экстракт – 5 мл, глюкоза – 10 г, NaCI – 5 г, СаСl2 – 0,5 г, вода водопроводная – до 1 л. Выращивание термофильных культур следует производить при температуре от 55 °С до 60 °C.

Однако поиски продуцентов новых антибиотиков из группы актиномицетов требуют выделения из природных источников новых форм этих микроорганизмов, обладающих иными физиолого-биохимическими свойствами. Применяя новые не стандартные методы выделения актиномицетов, используя необычные субстраты и образцы почв, отобранные в разнообразных экологических условиях и географических зонах, в последнее время удалось показать, что действительно в природе имеются формы актиномицетов, о которых ранее не было известно. Изолированы, например, актиномицеты, способные развиваться при пониженных температурах. Среди этих форм обнаружены продуценты антибиотиков, например, криомицина.

В природе существуют ацидофильные актиномицеты, которые лучше растут в условиях кислой среды (рН 3,5-6,5). Ацидофильные актиномицеты образуют антибиотические вещества, обладающие противогрибковым действием. Выделены новые формы актиномицетов, предпочитающие для своего развития щелочные условия, это так называемые алкалофильные организмы.

Среди новых форм актиномицетов встречаются и галофильные виды, способные расти лишь в средах, содержащих высокие концентрации минеральных солей (например, не менее 10 % NaCl).

Микроскопические грибы предпочтительнее развиваются на средах с несколько пониженным значением рН (4,5-5,0), на которых плохо растут многие бактерии и актиномицеты. Выделение грибов можно производить как на синтетических (например, среда Чапека), так и на сложных по составу натуральных (например, сусло-агар) средах с начальным рН 4,5-5,0.

Среды, пригодные для выделения микроорганизмов, не всегда благоприятны для образования ими антибиотических веществ. Так, многие актиномицеты хорошо растут на простых синтетических средах, но не все штаммы синтезируют на этих средах антибиотические вещества. Иногда для образования антибиотика необходимо организм культивировать на натуральных средах, таких как бульон Хоттингера, картофельный отвар и т.п. Аналогичное явление может иметь место в отношении некоторых видов бактерий и плесневых грибов. Например, для выяснения антибиотического действия актиномицетов рекомендуется среды рН которых следует поддерживать на уровне 6,8. При выделении продуцентов новых антибиотиков для культивирования микроорганизмов следует шире применять различные селективные среды, в том числе и среды, содержащие антибиотики.

Приведенные примеры значительно расширяют имеющиеся представления о физиолого-биохимических особенностях группы актиномицетов. Исследователи, занимающиеся поисками продуцентов новых антибиотических веществ, должны иметь в виду эти особенности, с тем, чтобы обеспечить максимально возможные условия для развития всех имеющихся в природе форм актиномицетов. Выделение новых форм микроорганизмов позволяет надеяться на получение новых антибиотических веществ с ценными свойствами.

3.2 Основные методы выделения микроорганизмов-продуцентов антибиотиков

Высев почвенной взвеси в воде на поверхность агаровой пластинки . Определенная навеска почвы, тщательно растертая в ступке с небольшим объемом воды, количественно переносится в колбу со стерильной водой. Содержимое колбы встряхивается в течение 5 мин, а затем из водной суспензии делается ряд последовательных разведений, которые высеваются на соответствующую агаризованную среду.

Для получения в дальнейшем чистых культур отдельные колонии после инкубации в термостате при нужной температуре пересеваются в пробирки со скошенным питательным агаром. Каждая чистая культура микроорганизма пересевается на различные по составу среды и после достаточно хорошего развития проверяются ее антибиотические свойства. Высев почвы на питательный агар, предварительно засеянный тест-организмом. Поверхность питательного агара засевается тест-культурой необходимого организма, после чего на агаровую пластинку раскладывают небольшие, не более просяного зерна, комочки почвы или же почву наносят в виде пыли, распределяя ее по всей поверхности пластинки. Затем чашки помещают в термостат и через определенный промежуток времени (24-48 ч, а иногда и более) просматривают кусочки почвы или отдельные ее участки, вокруг которых образовались зоны задержки роста тесторганизма. Из этих участков выделяют чистые культуры организмов и подвергают их дальнейшему изучению.

Метод обогащения почвы . Почву, из которой предполагают выделить антагонистов, обогащают организмами тех видов, по отношению к которым хотят получить антагонист. С этой целью к образцам почвы, помещенным в стеклянные сосуды, систематически добавляют отмытую суспензию нужных микроорганизмов. Затем через определенные промежутки времени такая почва высевается в виде отдельных комочков на агаровые пластинки в чашках Петри, предварительно засеянные тем же самым организмом, который использовался для обогащения почвы.