Алексей Сизенцов - Антибиотики и химиотерапевтические препараты Страница 12

Исходя из этого, предложено для идентификации внешне сходных культур актиномицетов применять метод так называемого перекрестного антагонизма.

Перекрестный антагонизм. Метода основан на том, что агаровые блочки с одним видом выращенного актиномицета помещают на поверхность агаровой пластинки, засеянной другим видом актиномицета. В качестве тесткультуры используется тот же штамм организма. При этом обнаруживается, что один вид актиномицета-антагониста подавляет рост других видов актиномицетов и не подавляет развитие своего вида (таблице 1).

Таблица 1 – Перекрестный антагонизм у некоторых видов актиномицетов (по Красильникову, 1951)

Метод специфики межвидового антагонизма может быть использован лишь при идентификации внешне очень близких видов актиномицетов и, повидимому, не может оказать существенной помощи при систематике далеко стоящих видов. Однако необходимо иметь в виду, что при перекрестном антагонизме изучаемый штамм актиномицета иногда не подавляет роста других известных видов, но он может не принадлежать ни к одному из этих видов. Так, Str.griseus не подавляет роста Str.rimosus, хотя это совершенно различные виды. Или в присутствии Sir.lavendulae не происходит подавления развития Sir.griseus (таблица 2).

Таблица 2 – Явление перекрестного антагонизма между отдельными видами актиномицетов (по Teillon, 1951)

При использовании метода перекрестного антагонизма следует иметь в виду также возможность самоугнетения, которое иногда имеет место среди некоторых штаммов актиномицетов. Культура Str.lavendulae штамм 2335 выделяет вещества, вызывающие самоугнетение, напоминающее действие лизинов. Вокруг агаровых блочков этой культуры образуются зоны отсутствия роста Str.lavendulae. Природа этих веществ пока неизвестна.

Оценивая все случаи, которые могут иметь место при использовании метода перекрестного антагонизма, следует заметить, что данный метод не помогает решению вопроса идентификации видов, но может оказать большую помощь при подразделении на виды культур внутри отдельных групп актиномицетов. Широкое применение при идентификации микроорганизмовпродуцентов антибиотиков нашли и другие методы.

Использование форм организмов, устойчивых к определенному антибиотическому веществу. В основу этого метода положены два основных признака, связанных с образованием и действием антибиотиков.

1. Каждый антибиотик образуется одним или несколькими определенными видами микробов.

2. Микроорганизмы, устойчивые к определенному антибиотику, устойчивы также к антибиотическим веществам, близким по химическому строению и биологическим свойствам к первому антибиотику. Вместе с тем они могут обладать чувствительностью к антибиотикам, имеющим другую химическую природу и, следовательно, другое биологическое действие.

Определение антибиотика, образуемого неизвестным организмом, может быть проведено путем испытания его биологического действия на ряд микроорганизмов, чувствительных и устойчивых к известным антибиотикам. Таким путем можно выяснить сходство или различие биологического действия изучаемого вещества и известных антибиотиков и тем самым решить вопрос о химическом сходстве или различии этих веществ.

Для исследования этого явления изучаемый организм высевают на поверхность питательного агара в виде штриха или в виде отдельной макроколонии в центре чашки Петри. Образуемое организмом антибиологическое вещество диффундирует в окружающий агар и создает определенную зону. Пересекая эту зону чувствительными и устойчивыми к определенному антибиотику микроорганизмами, можно выяснить сходство биологического действия изучаемого препарата с известным антибиотиком. Установив сходство биологического действия исследуемого вещества с известным антибиотиком, можно предположить, что изучаемое соединение относится к определенной группе антибиотических веществ и образуется соответствующими организмами.

Однако следует иметь в виду, что оценка принадлежности изучаемого организма к тому или иному виду продуцентов может быть лишь ориентировочной. Так, было известно, что b-лактамные антибиотики образуются только плесневыми грибами, но последующие исследования показали, что антибиотические вещества этой природы образуют некоторые виды стрептомицетов и собственно бактерий.

Метод хроматографии Хорошим методом для идентификации антибиотиков и их продуцентов является метод хроматографии, открытый выдающимся русским ученым Цветом еще в 1903 г. и теперь очень широко используемый в лабораторной практике. Метод широко применяется при идентификации антибиотиков на ранних стадиях исследования, что имеет весьма важное значение. Определение антибиотика на ранних стадиях работы может значительно сократить время его изучения. Иногда метод хроматографии бывает необходимо дополнить данными методов электрофореза, которые помогают выяснить прежде всего ионный характер антибиотика.

Метод бумажной хроматографии антибиотиков состоит в следующем. На полоски хроматографической бумаги длиной 20-30 см и шириной в 1 см наносится испытуемый антибиотик. Подсушенные на воздухе полоски хроматографической бумаги с нанесенным антибиотиком помещают затем в хроматографический бак или цилиндр с соответствующим растворителем на 10-20 ч. Время выбирается в зависимости от скорости прохождения растворителя и от высоты используемого сосуда для хроматографии.

Для обнаружения антибиотиков па хроматограммах могут применяться биологические, химические и физические методы.

Наиболее распространенным методом обнаружения антибиотиков на хроматограммах является биоавтографический метод. С этой целью высушенные в вытяжном шкафу полоски бумаги накладываются на агаровую пластинку, предварительно засеянную культурой тест-организма, чувствительной к изучаемому антибиотику. Кюветы с полосками бумаги помещают в термостат на 18-20 ч при температуре, оптимальной для роста тест-организма. По зонам отсутствия роста тест-микроба, образующимся вокруг тех мест на хроматограмме, где находится пятно антибиотика, судят, во-первых, об однородности антибиотика; во-вторых, сравнивают полученные хроматограммы с хроматограммами известных антибиотических веществ (рисунок 1).

а – стандартный раствор пенициллина G; б, в – хроматограмма производственных образцов 1950 г. За пятном пенициллина G (вверху) следуют пенициллин F, дигидро F и самая нижняя зона – пенициллин К; г – хроматограмма конечного препарата калиевой соли (1950).

Рисунок 1 – Использование метода бумажной хроматографии для разделения пенициллинов, образуемых штаммом Q-176 на кукурузной среде с лактозой

Химические методы обнаружения антибиотиков на хроматограммах основаны на реакциях, в результате которых образуются соединения, выявляемые по соответствующей окраске или обесцвечиванию реактива в месте расположения пятна антибиотика.

Физические методы обнаружения антибиотиков включают в себя способы, связанные:

а) с выявлением люминесценции антибиотического пятна в ультрафиолетовом (УФ) возбуждении;

б) с поглощением УФ излучения;

в) с определением радиоактивной метки антибиотика.

Для целей бумажной хроматографии антибиотиков с успехом можно использовать и круговые хроматограммы.

Важное значение при оценке результатов хроматографии имеет положение пятен исследуемых веществ, характеризуемое коэффициентом Rf. Коэффициент Rf определяется отношением расстояния, которое проходит пятно изучаемого вещества от линии старта за определенное время, к расстоянию фронта растворителя, прошедшего от линии старта:

где Sp – расстояние, пройденное пятном изучаемого вещества;

Sf – расстояние фронта растворителя, пройденное от старта.

Воспроизводимость значении Rf зависит от постоянства следующих факторов: качества бумаги, температуры, степени чистоты растворителей, состава газов атмосферы, в которую помещена бумага, однотипности процедур и аппаратуры.

При использовании метода хроматографии па бумаге для идентификации антибиотиков было показано, что значение Rf зависит также и от системы растворителей, от степени очистки изучаемого антибиотика и от состава культуральной жидкости.

По спектру значении Rf или, как его иногда называют, по хроматографическому спектру можно четко различать группы химически родственных антибиотиков и до некоторой степени отличать также антибиотики внутри групп.

Существенное значение при использовании бумажной хроматографии для идентификации антибиотиков имеет разработка методов, позволяющих проводить эти исследования на ранних этапах изучения антибиотических веществ, т.е. на стадии культуральных жидкостей. Однако при этом встречаются большие затруднения в разгонке антибиотиков, так как факторы, оказывающие влияние на значение Rf, часто встречаются при использовании культуральных жидкостей.