Коллектив авторов - Молекулярная морфология. Методы флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии Страница 3

В ксеноновой лампе вспышка происходит после ионизации газа и прохождении через него мощного импульса электрического тока, поданного на поджигающий электрод. В результате этого электроны в молекуле ксенона занимают орбиты с более высокими энергетическими уровнями и, возвращаясь на прежние орбиты, излучают энергию в виде фотонов. Ксеноновая лампа имеет непрерывный спектр излучения в широком спектральном диапазоне, что не всегда пригодно для возбуждения флуоресценции. Такие лампы обычно используют при работе с флуорохромами, требующими для возбуждения длинноволновый свет (красной и инфракрасной области).

Вместо ртутной или ксеноновой лампы можно использовать металлогалогенную лампу (metal halide lamp). Это газоразрядная лампа высокого давления. Внутри колбы размещается кварцевая или керамическая цилиндрическая горелка, в которой находятся галогениды некоторых металлов (йодиды натрия, таллия, индия и др.), инертный газ (преимущественно ксенон и аргон) и металлическая ртуть. При подаче на лампу питающего напряжения происходит зажигание дугового разряда, металл начинает испаряться, его атомы возбуждаются, что приводит к возникновению излучения. В зависимости от состава металлов различаются и спектры излучения ламп. Обычно компоненты подбираются так, чтобы компенсировать недостаток красного и желтого света в спектре ртути, что немаловажно при использовании возбуждаемых светом этого диапазона флуорохромов (например, флуоресцеина). Кроме этого, лампы данного типа компактны, экономичны в использовании, для них характерен пониженный уровень тепловой отдачи.

Источник возбуждения флуоресцентного излучения может быть выполнен в виде одного или нескольких светоизлучающих диодов, причем возможно использование диодов, имеющих как одинаковую длину волны излучения, так и различную. Применение светодиодов позволяет избежать нагревания системы, увеличивает срок ее эксплуатации.

Лазеры в качестве источника света используются в основном в сканирующих устройствах для обеспечения высокой интенсивности освещения в узкой спектральной области и на малой площади образца. В таких микроскопах остросфокусированные световые лучи лазера сканируют образец точку за точкой. Поскольку лазеры испускают свет в узкой спектральной области, пропадает необходимость применения возбуждающих светофильтров. Однако при использовании флуорохромов, которые возбуждаются на разных длинах волн, требуется применять разные лазеры или же прибегать к различного рода приемам.

Фильтры.

Фильтр возбуждающего света подбирается таким образом, чтобы он выделял из спектра лампы свет той длины волны, которая максимально эффективно поглощается флуорохромом. Например, выпускаются светофильтры под стандартные флуорохромы для «синей», «зеленой», «красной» люминесценции или под несколько стандартных флуорохромов (например, возбуждающий светофильтр BP 560/40 нм для «красной» люминесценции или возбуждающий светофильтр под несколько флуорохромов BP 370/40, BP 474/28, BP 585/35 нм производства фирмы Carl Zeiss).

Дихроичные зеркала (интерференционные светофильтры) имеют специальное интерференционное покрытие, позволяющее отражать свет, длина волны которого меньше определенного значения, и пропускать излучение с большей длиной волны. В данном случае возбуждающее излучение отражается, а сигнал флуоресценции полностью пропускается. Для получения таких фильтров на поверхность прозрачной пластины наносят несколько (от 10 до 200) слоев материала с чередующимися высоким и низким показателями преломления. Например, PbCl2, TiO2, ZnS (показатель 2,2 – 2,3) и MgF2, SiO2, Na3AlF6 (показатель 1,3 – 1,4). Толщина каждого слоя тщательно выдерживается (используется техника вакуумного напыления), поскольку этот параметр определяет положение максимума кривой пропускания. От числа слоев зависит ширина зоны пропускания фильтра и степень подавления «ненужной» части спектра.

Запирающие фильтры (band pass BP). При конструировании запирающих фильтров используют комбинацию длинноволновых отрезающих (shot pass filter, или SP filter) и длинноволновых пропускающих (long pass filter, или LP filter) фильтров. Первые задерживают длинноволновый свет, но пропускают коротковолновый, а LP-фильтры, напротив, пропускают длинноволновый свет, задерживая коротковолновый. Комбинируя эти фильтры, можно добиться того, что через фильтр будет проходить только свет определенного участка спектра. Запирающий фильтр выбирают в соответствии с фильтром возбуждающего света. Например, при установке возбуждающего светофильтра BP 560/40 нм используют запирающий светофильтр BP 630/75 нм.

Сближение в пространстве всех светофильтров позволило объединить их в единый светоделительный модуль. Такая конструкция обеспечивает производство легкой замены или смены модуля и дает возможность применять несколько флуорохромов одновременно, с высокой точностью совмещая полученные изображения. При приобретении флуоресцентного микроскопа необходимо серьезно подходить к вопросу о выборе светоделительных модулей, принимая во внимание поставленные задачи и спектральные характеристики имеющихся флуорохромов. Если планируется использовать несколько флуоресцентных красителей, необходимо учитывать, что спектры излучения флуорохромов не должны перекрываться. В противном случае возможны ошибки в интерпретации данных.

Детекторы флуоресцентного сигнала. Усиление и детектирование сигнала производится с помощью фотоэлектронного умножителя (ФЭУ) и цифровой видеокамеры. ФЭУ – это электровакуумный прибор, в котором поток электронов, излучаемый фотокатодом, усиливается в умножительной системе в результате вторичной электронной эмиссии. В результате фотоэффекта при попадании фотона на фотокатод из него вылетают электроны, которые, ускоряясь в электрическом поле, направляются на систему динодов (специальный электрод), где за счет вторичной электронной эмиссии образуют нарастающую (от динода к диноду) электронную лавину, поступающую на анод. Обычно коэффициент усиления ФЭУ (число электронов, достигших анода при выбивании из фотокатода одного электрона) составляет около 106, что позволяет получить на выходе ФЭУ легко регистрируемый сигнал.

Цифровые камеры в качестве светочувствительного элемента имеют CCD-матрицу (charge-coupled device), она же ПЗС-матрица (сокр. от «прибор с зарядовой связью»). CCD-матрица является специализированной интегральной аналоговой микросхемой, которая представляет собой набор резисторов. Количество этих ячеек (элементов) в матрице является основной определяющей разрешения и качества картинки. Принцип работы CCD-матрицы следующий: свет, попавший на матричные элементы, преобразуется в электрический заряд, формируется зарядовая картина, которая пропорциональна освещенности в каждой ячейке. Матрица может «накапливать» заряды в течение определенного периода времени. Общий заряд, накопленный в ячейке, равен произведению зарядов на время экспонирования. Для получения цветной картинки, как правило, световой луч еще проходит через набор специальных светофильтров/призм зеленого, синего и красного цвета. С более подробным описанием принципов работы отдельных модулей флуоресцентного микроскопа можно ознакомиться в пособии В. И. Голышевской [и др.] (2008) и в работе H. C. Ishikawa-Ankerhold [et al.] (2012).

1.3. Принципы конфокальной микроскопии

Конфокальная микроскопия является разновидностью флуоресцентной микроскопии с улучшенным разрешением вдоль оптической оси объектива, которое достигается за счет использования принципа конфокальной фильтрации флуоресценции. Концепция конфокальной микроскопии была предложена Marvin Minsky в 50-е гг. XX в. для исследования ткани головного мозга без предварительного окрашивания. В разработанном им микроскопе свет последовательно фокусировался на разных точках образца. С целью устранения шумового сигнала от участков, расположенных вне плоскости фокуса, использовалась диафрагма. Она находилась в плоскости, сопряженной с плоскостью фокуса объектива, таким образом, что при проецировании диафрагмы на объект ее изображение точно совпало с фокусом освещающего объект света. При таком устройстве системы свет из областей вне фокуса задерживался диафрагмой и на детектор попадал только сигнал из фокуса объектива. Изменяя диаметр диафрагмы, можно было варьировать толщину оптического слоя вблизи фокуса объектива, от которого измерялся сигнал. Сканирование плоскости образца по точкам позволяло получить полное изображение. Исходя из этого принципа, возникло и название метода – «конфокальный» – основанный на сопряжении фокусов. Однако при таком устройстве микроскопа на изображении было слишком много помех из-за использования слабых источников освещения. Вероятно поэтому изобретение Minsky осталось почти без внимания. Интерес к нему вернулся только после изобретения лазера. Более подробно исторические аспекты создания конфокального микроскопа приведены в обзоре Н. Н. Лукашевой [и др.] (2008).