Эвелина Хаджиева - Гнойно-септическая инфекция в акушерстве и гинекологии Страница 9

Иммуноферментный анализ(ИФА). Применяют варианты твердофазного иммуноферментного анализа с использованием диагностических наборов фирм «Syva», «Daco diagn.», «Abbott». Чувствительность ИФА 70 – 90 %. Главное преимущество заключается в объективном учете реакции антиген – антитело с помощью спектрофотометра. Используются антитела к хламидийным антигенам, конъюгированные с ферментами (пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой и др.). При положительной реакции антиген – антитело, т. е. при наличии в биопробе хламидий, высвобождается фермент, который реагирует на субстрат, специально вводимый в реагирующую смесь, при этом образуется цветное соединение. По интенсивности цвета, регистрируемой с помощью спектрофотометра, судят о наличии и количестве хламидий в материале. Современные аппараты типа Quantum, Multiscan снабжены принтером и дают распечатку полученных результатов. Для постановки реакции требуется в среднем 5 ч. Следует учитывать, что ПИФ, НИФ и ИФА могут давать положительный результат при наличии в пробе нежизнеспособных хламидий, а также (редко) других бактерий, имеющих перекрестно реагирующие антигены.

На основе ИФА построены экспресс-методы, которые выдают ответ через 5 – 15 мин. Требуется осторожность при их использовании, так как возможны ложноположительные и ложноотрицательные результаты.

Молекулярно-биологические методы. Они основаны на способности ДНК к гибридизации. В эту группу входят ДНК-гибридизация, полимеразная цепная реакция (ПЦР), лигазная цепная реакция (ЛЦР).

Все они позволяют выявить генетический материал возбудителя (уникальные высокоспецифические участки ДНК/ РНК) в исследуемом материале. В 1983 г. была открыта ПЦР и в настоящее время успешно внедряется в разные области биологии, медицины, в частности, в лабораторную диагностику инфекций.

В основе метода ПЦР лежит комплементарное достраивание ДНК-матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК. Естественная репликация ДНК включает в себя несколько стадий:

1. Денатурация ДНК – расплетение двойной спирали, расхождение нитей ДНК.

2. Образование коротких двухцепочечных участков ДНК (затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК).

3. Синтез новой цепи ДНК (комплементарное достраивание нити).

Открытие термостабильной ДНК-полимеразы (Tag-полимеразы) из термофильных бактерий Thermis aquaticus, оптимум работы которой находится в зоне 70 – 72 C, позволило сделать процесс репликации ДНК циклическим. При многократном повторении циклов синтеза происходит экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента ДНК, что позволяет из небольшого количества анализируемого материала, который может содержать единичные клетки микроорганизма, получать достаточное количество копий ДНК для идентификации их методом электрофореза в геле или ИФА.

Комплементарное достраивание цепи начинается не в любой точке ДНК, а только в определенных стартовых блоках – коротких двунитевых участках. При присоединении таких блоков к специфическим участкам ДНК можно направить синтез новой цепи только в этом участке, а не по всей длине ДНК-цепи. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют две олигонуклеотидные затравки (20 нуклеотидных пар), называемые праймерами. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. Таким образом, метод ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка ДНК, катализируемое ДНК-полимеразой.

Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона). В последующих циклах ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2n, где n – число циклов амплификации. Даже если в исходном материале первоначально находилась одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30 – 40 циклов амплификации накапливается 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверного визуального определения этого фрагмента методом электрофореза в геле или методом ИФА. Высокая специфичность и чувствительность метода позволяет обнаружить единичных возбудителей в исследуемом материале, но требует специального оборудования, специально подготовленного персонала, знающего особенности возбудителя и способного строго контролировать технологические особенности метода. Зарубежные фирмыпроизводители диагностических наборов для ПЦР и ЛЦР – «Roch-Diagn.», «Abbott», «Murex» и др. Отечественные фирмы – «ЛИТЕХ», «НИАРМЕДИК» и др.

Серологический метод. Основан на выявлении антител к антигенам хламидий, которые циркулируют в крови или присутствуют в отделяемом слизистых оболочек в результате иммунного ответа организма на внедрение возбудителя. Большинство инфекционных процессов, вызванных C. trachomatis, локализуется в пределах слизистых оболочек, поэтому антигенная стимуляция невелика, за исключением случаев генерализации восходящей инфекции у женщин, мужчин и новорожденных детей, инфицированных в родах. Поэтому кровь для серологического исследования целесообразно брать в период ярких клинических проявлений, преимущественно системного характера. Используют метод микроиммунофлюоресценции (МИФ) и иммуноферментный анализ. Для МИФ используют реактивы фирмы «Labsystems» (Финляндия) или отечественные наборы фирмы «НИАРМЕДИК».

В качестве антигена для МИФ используется смесь элементарных и ретикулярных частиц, выращенных в желточных мешках развивающихся куриных эмбрионов. В этой реакции определяются IgG, IgA, IgM к антигену хламидий. Постановка реакции осуществляется микрометодом. На предметное стекло наносят антиген и фиксируют холодным ацетоном 5 – 10 мин. Затем каплями наносится исследуемая сыворотка в разведении 1/4 – 1/1024, препарат инкубируется при температуре 37 C 15 мин, тщательно отмывается на магнитной мешалке фосфатно-солевым буфером 20 мин. После этого наносится антивидовая флюоресцирующая сыворотка против глобулинов человека (анти-IgG, анти-IgA, анти-IgM), инкубируется 15 мин во влажной камере при температуре 37 C. После тщательного промывания в фосфатно-солевом буфере препарат просушивается, на него наносится капля забуференного глицерина. Препарат накрывается покровным стеклом и микроскопируется в люминесцентном микроскопе. На желто-оранжевом фоне выявляются ярко-зеленые флюоресцирующие комплексы антиген – антитело в виде «звездного неба».

Иммуноферментный анализ для определения специфических IgG, IgA, IgM антител проводится в строгом соответствии с инструкцией к каждому конкретному набору.

Серологические реакции весьма ограниченно применяют для диагностики генитальных инфекций. Диагностический титр в МИФ 1/64 (IgG). При использовании ИФА об активной генитальной инфекции говорит наличие IgA > 1/16, IgG > 1/128, а также наличие IgM. При цервиците об острой или активной инфекции говорит наличие IgM > 1/20, IgG > 1/64, при сальпингите IgG > 1/128, у мужчин с негонококковыми уретритами – IgG > 1/32, при венерической лимфогранулеме IgG > 1/256. Важно определить сероконверсию в парных сыворотках, взятых с интервалом 2 нед. Лишь четырехкратное нарастание титра антител может говорить о текущей инфекции.

Антихламидийные антитела (IgG) длительно сохраняются в крови после перенесенного заболевания (5 – 10 лет), поэтому они не могут быть использованы в качестве контроля излеченности. Контроль излеченности следует проводить не ранее чем через 2 нед., предпочтительно через 2 мес., так как возможны ложноположительные результаты за счет сохранения антигенов погибших хламидий. Контроль целесообразно проводить культуральным методом или двумя взаимно дополняющими методами.

Неправильно поставленный диагноз урогенитального хламидиоза и неадекватное лечение ведет к нарушению микробиоценоза гениталий и появлению дополнительных осложнений.

УРОГЕНИТАЛЬНЫЕ МИКОПЛАЗМОЗЫ

Микоплазмы относятся к семейству Mycoplasmataceae, входящему в порядок Mycoplasmatales класса Mollicutes. Микоплазмы широко распространены в природе, они обнаружены у млекопитающих, птиц, рыб, моллюсков, насекомых, растений.

Человек является естественным хозяином по крайней мере 14 видов микоплазм. Однако их патогенность для человека доказана лишь для 4 видов: Mycoplasma pneumoniae, M. hominis, M. genitalium, U. urealyticum. Последние 3 вида принято называть генитальными микоплазмами.

• M. genitalium первоначально была выделена из урогенитального тракта. Однако, подобно M. pneumoniae, обладает выраженным пневмотропным действием и весьма близка с этим видом по биологическим, генетическим и антигенным свойствам. Вопрос о патогенной роли M. genitalium в поражениях урогенитального тракта окончательно не прояснен.