Галина Ильина - Ксилотрофные базидиомицеты в чистой культуре Страница 2

Исследователи приходят к пониманию принципиального значения установления сходства между химическим составом природных плодовых тел и культуральным мицелием, выращенным на элективных питательных средах. Делаются результативные попытки воздействием на условия культивирования добиться улучшения таких важных показателей культивируемого мицелия, как содержание белка, отдельных аминокислот и т.д. (Высшие съедобные базидиомицеты… 1983; Dijkstra, 1976). Многими исследователями отмечалась явная недооценка важности микологических аспектов проблемы глубинного культивирования высших базидиальных грибов, и, в частности, получения чистой культуры. По сведениям А.С. Бухало, вышеуказанная проблема привела к тому, что практически все штаммы базидиальных грибов (гименомицетов), отобранные в 50-70-е годы для промышленного культивирования, оказались несовершенными гифомицетами (Бухало, 1988). Это привело к некоторому пессимизму в оценке возможного использования высших съедобных базидиомицетов в качестве продуцентов биомассы и затормозило исследования в этой области. Более того, на тот момент возникла ложная концепция, утверждающая, что в культуре образуются физиологические мутанты с несвойственными высшим базидиомицетам спороношениями. Таким образом, возникла насущная необходимость разработки культуральных приемов идентификации (Nobles, 1948, 1965).

Именно в чистой культуре возможно и необходимо проведение описания культурально-морфологических признаков штаммов. Первая большая работа в этом направлении проведена чешским микологом М. Семерджиевой (Semerdgieva, 1965; Семерджиева, 1977, 1984). Работы этого автора, посвященные изучению культурально-морфологических признаков гименомицетов в условиях чистой культуры, вышли в свет значительно раньше, чем широко известная и рекордное количество раз цитируемая специалистами этого направления работа Дж. Сталперса (Stalpers, 1978). Работы Дж. Сталперса содержат примеры описания колоний высших базидиомицетов. Классификация типов мицелиальных колоний в соответствии с подходами этого автора активно используется при характеристике культуральноморфологических свойств различных штаммов.

Несомненно, огромнейший вклад в развитие приемов лабораторного и промышленного культивирования высших базидиомицетов внесли А.С. Бухало, И.А. Дудка, Н.А. Бисько, В.И. Билай. В их многочисленных монографиях содержится вся необходимая практическим микологам информация о работе с чистой культурой (Билай и др., 1983; Высшие съедобные базидиомицеты…1983; Бисько и др., 1986; Бухало, 1988; Дудка и др., 1992; Бисько и др., 2001, 2010). Для более полного описания культуральноморфологических особенностей штаммов А.С. Бухало предложено использовать расчетный показатель РК (ростовой коэффициент), который, кроме скорости роста учитывает и такие важные показатели, как интенсивность формирования воздушного мицелия. Сборники под редакцией В.И. Билай содержат описания методов изучения морфологии, физиологии, биохимии грибов, в том числе данные о жизнедеятельности культур грибов в экстремальных условиях (Методы экспериментальной микологии, 1973, 1982). Общим контекстом, объединяющим работы, выступает утверждение о том, что экспериментальное изучение высших базидиальных грибов стало возможным только благодаря разработке доступных методов получения чистых культур этих грибов. Этот момент в развитии экспериментальной микологии можно считать периодом окончательного осознания исключительного статуса чистой культуры.

Интенсификация микологических исследований в условиях чистой культуры в последней четверти XX века связана с развитием и распространением любительского и промышленного грибоводства. В этом контексте несколько иное понимание получает термин «штамм», который подразумевает в практическом грибоводстве чистую генетическую линию, которая может быть получена путем вегетативного иссечения изолята из плодового тела. Таким образом, возникает синонимика между понятиями штамм и изолят. Именно в этом направлении практической микологии возникают такие термины, как маточная, посевная культура. Так, в ряде рекомендаций по выращиванию посевного мицелия с целью использования в практическом грибоводстве, отмечается: «Штамм – чистая культура грибов, отличающаяся особыми признаками и ценными свойствами. Штамм размножают не спорами, а с помощью "чистой культуры" (она же стволовая, она же маточная культура), и здесь уже имеется в виду именно чистота в смысле генетической чистоты линии штамма» (Рекомендации…1983).

В наших исследованиях мы придерживаемся следующей трактовки определения «штамм»: чистая культура определенного вида, выделенная из базидиомы (или базидиом, растущих совместно), тканевым или споровым способом, для которой изучены культурально-морфологические свойства и особенности микроморфологии. В зависимости от способа выделения и прочих особенностей могут различаться ди- и монокариотические штаммы, тканевые и споровые изоляты.

Ведение научных исследований, в том числе, селекционная работа, для обеспечения генетической чистоты материала, часто предполагает выделение не изолята, а именно моноспоровой культуры – культуры гриба, полученной из одной споры, что обеспечивает работу с генетически чистым материалом. К использованию таких культур прибегают при изучении физиологической разнородности особей гомоталличных видов в пределах вида, штамма или расы, при изучении изменчивости, установления цикла развития, скрещивании и т.д. Моноспоровую культуру получают методом серийного разведения или с помощью микроманипулятора (Камзолкина, 1996). Для выделения моноспоровых культур методом серийного разведения вначале получают споровые отпечатки из спорулирующих плодовых тел.

Определенный вклад в развитие отечественного грибоводства внесла монография Дворниной А. А. «Базидиальные грибы в искусственной культуре», вышедшая в 1991 году. Особое место в исследованиях базидиальных грибов было отведено возможности получения грибной биомассы на жидких питательных средах при глубинном культивировании (Дворнина, 1990; Кожемякина и др., 2008).

В современный период все большую актуальность приобретают исследования, связанные с изучением in vitro базидиальных макромицетов – продуцентов биологически активных веществ, используемых для профилактики и лечения заболеваний человека. Это вещества различной химической природы, в основной своей массе являющиеся вторичными метаболитами грибов названной группы. Различные стороны биохимии и физиологии видов – продуцентов изучаются, в основном, в условиях чистой культуры (Гарибова и др., 1999; Феофилова и др., 1994, 1996, 1998, 2000; Феофилова и др., 1994, 1998; Гарибова и др., 2003; Краснопольская и др., 2003;Бабицкая и др., 2007; Соболева и др., 2007; Соболева, 2010; Wasser, Weis, 1999; Smith et al., 2002; Wasser, 2002; Roberts, 2006). В частности, скрининг перспективных штаммов, анализ разных сторон вторичного метаболизма проводится с использованием именно лабораторного культивирования мицелия (Завьялова и др., 2005; Ильина и др., 2009; Постнова, 2009). Результаты экспериментов, полученных при работах с чистыми культурами, имеют большое научно-практическое значение. Признано, что использование именно быстро наращиваемого мицелия (например, глубинного) для получения ценных метаболитов в большинстве случаев выгоднее и удобнее, чем использование плодовых тел (Краснопольская и др., 2005; Автономова и др., 2006; Автономова, Краснопольская, 2007; Краснопольская и др., 2008)). Многие активные начала идентифицированы в культуральной жидкости, то есть они в принципе не могли быть получены «в обход» чистой культуры.

Таким образом, следует признать исключительность статуса чистой культуры в микологических исследованиях, связанных с изучением самых разных сторон жизнедеятельности грибов.

Одним из первостепенных приемов, предваряющих любые лабораторные исследования, связанные с микроорганизмами, является выделение и поддержание чистых культур, что подразумевает создание коллекции. Коллекции микроорганизмов создаются в разных целях: для более глубокого познания разнообразия микробного мира, населяющего разные природные субстраты, изучения биологических особенностей разных видов, их функциональных различий, а также извлечения из каждого вида той пользы, которая в закодированном виде содержится в геноме (Лугаускас, Репечкене, 2002). Поэтому объем и специфика коллекций определяются, безусловно, целями исследований и направлениями научных изысканий. Практика создания коллекций культур микроорганизмов имеет давнюю историю. Естественно, что поддержание чистых культур в составе коллекций стало возможным лишь с появлением специальных средств (холодильные установки, стерилизаторы и т.п.). XX век был ознаменован бурным развитием коллекций культур микроорганизмов во всем мире, в связи с чем скоро возникла необходимость их общей систематизации. Наиболее существенные итоги работы коллекций культур в Европе и в мире были подведены в 1981 году, в г. Брно (ЧССР), где с 20 по 24 июля проходила IV Международная конференция по коллекциям культур. Конференция была организованная Всемирной федерацией по коллекциям культур (WFCC), Чехословацкой коллекцией микроорганизмов (ССМ) при Университете Пуркине, Брно и Чехословацким микробиологическим обществом. Доклады, сделанные 250 представителями из 42 стран мира касались роли культур в науке, образовании, медицине и промышленности; хранения культур; биоопасности в коллекциях и их контроля; методов выделения и очистки культур. Подробный анализ деятельности конференции сделан Л.А. Беляковой и В.М. Благодатской (Белякова, Благодатская, 1983). В работе дан обзор состояния и деятельности существующих на тот момент европейских коллекций культур микроорганизмов: основанной в 1963 году Чехословацкой коллекции микроорганизмов (ССМ) при Университете Пуркине, г. Брно; созданной в 1964-1965 годах коллекции культур грибов (CCF) Карлова Университета в г. Праге; Чехословацкой коллекции культур грибов, разрушающих древесину, организованной еще в 1948 году в г. Братиславе профессором Рипачеком; богатой штаммами базидиомицетов коллекции культур (CBS) в г. Баарне, Нидерланды; коллекции Микологического института (CMI), г. Кью, Англия, основанной в 1947 году; коллекции культур высших грибов в г. Веймаре, Германия; наконец, коллекции культур базидиальных грибов Норвежского лесного исследовательского института, основанной в 1937 году. Большой объем информации имеется по коллекциям дрожжей.