Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2007 №5 - Федорочев Страница 65

Если, несмотря на все ваши сверхусилия сохраняется высокий уровень контаминации, есть несколько дополнительных способов повышения стерильности. Первый, самый простой и недорогой, использует коллоидный раствор лёгкого масла распыляемый в воздухе лаборатории; второй включает в себя изготовление камеры с неподвижным воздухом, т. н. главбокс (glovebox — ящик с перчатками); а третий относительно дорог, т. к. требует использования высокоэффективных микронных фильтров.

1 — При распылении стерильного масла создаётся облако крайне вязких, маленьких капель. По мере оседания оно связывает все находящиеся в воздухе частицы. В этом способе используется триэтиленгликоль, испаряемый с поверхости подогреваемого тампона. Мелкодисперсный и более летучий, чем минеральное масло, триэтиленгликоль не оставляет сколько-нибудь заметной масляной плёнки. Использование триэтиленгликоля не отменяет стандартные меры по поддержанию гигиены.

2 — Главбокс — это воздухонепроницаемая камера, которая предоставляет условия для создания стерильной среды, в которой и проводится работа с культурами. Простейшая конструкция представляет собой ящик из фанеры, со смотровым окошком. В отверстиях для рук закрепляются перчатки, в которые вставляются руки. Иногда вместо перчаток передняя часть ящика прикрываются сменной хлопковой тканью, которую следует периодически стерилизовать. Главное преимущество главбокса заключается в том, что он, являясь уменьшенным в масштабе и недорогим подобием лабораторной комнаты, предоставляет удобный для чистки объём, в котором нет или почти нет движения воздуха и можно спокойно работать со стерильными культурами.

3 — Современные лаборатории решают проблему инфекциии переносимой по воздуху установкой высокоэффективных воздушных фильтров частиц (high efficiency particulate air (HEPA) filter). Эти фильтры задерживают все частицы диаметр которых превышает 0,1–0,3 микрона, т. е. меньше любых спор грибов и практически всех бактерий (суть там довольно проста, воздух продувается через наэлектризованную высоким напряжением многослойную пластиковую сетку или фильтр и вся пыль прилипает к ней — прим. ред.). НЕРА-фильтры встраиваются в т. н. ламинарные шкафы. В некоторых стерильных лабораториях из НЕРА-фильтров набирается целиком герметичная стена или потолок и через них подаётся внешний воздух. В результате внутри лаборатории создаётся позитивное давление, которое не даёт проникнуть нестерильному воздуху. Устройство и типы ламинарных шкафов подробно обсуждаются в приложении IV.

У некоторых культиваторов практически не возникает проблем, при том что они работают в, казалось бы, совсем примитивных условиях (быстрые движения натренированных рук и понимание сути действий позволяют достичь очень высокого уровня стерильности — прим. ред.). Другие испытывают явные проблемы с постоянными заражениями и им приходится вкладываться в высокотехнологичные устройства контроля окружающей среды. Каждые конкретные условия вынуждают принимать определённые контрмеры. И независимо от того выращиваете ли вы грибы дома или организовываете работу лаборатории, вы испытаете одинаковые трудности отличающиеся лишь в масштабах.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ АГАРА

Завершив обустройство стерильной лаборатории следующим шагом можно приступать к приготовлению питательного носителя на основе агара. Агар — это вырабатываемое из морских водорослей студнеобразующее вещество, наподобие, но несколько более эффективное, чем желатин. Существует много рецептов приготовления обогащённых агаровых носителей пригодных для разведения грибной культуры. Стандартными можно считать картофельный (Potato Dextrose Agar (PDA)) и солодовый (Malt Extract Agar (MEA)) агары, которые нередко дополняют дрожжами в качестве питательной добавки. В микологических журналах часто упоминаются агары на пептоне и неопептоне — два самых доступных источника протеина для грибного мицелия. Есть ещё один тип агара, который авторы рекомендуют, на бульоне от варки ржи или пшеницы с добавлением солодового сахара (или мальтоза — дисахарид, образованный двумя остатками глюкозы).

Если вы испытываете трудности связанные с инфицированием бактериями, то добавление антибиотиков в питательный носитель предотвратит их размножение. Большинство антибиотиков, таких как стрептомицин, разрушаются в процессе автоклавирования и, поэтому их следует добавлять в агар после стерилизации, пока он жидкий. Один антибиотик, сульфат гентамицина, выдерживает автоклавирование и эффективен против широкого круга бактерий. Антибиотики негативно влияют на мицелий некоторых видов грибов.

Десятки обогащённых агаровых сред были успешно использованы для культивации грибов и у каждого грибовода складываются свои предпочтения основанные на личном опыте. Независимо от типа используемой агаровой среды, важнейшей её характеристикой является pH — логарифмическая шкала, отмечающая уровень кислотности или щёлочности в диапазоне от 0 (кислота) до 14 (щелочь), где 7 нейтральный уровень. Различные виды Psilocybe предпочитают носитель сбалансированный между 6,0–7,0, тогда как Agaricus brunnescens и близкие к нему лучше растут в нейтральной среде. По большей части мицелий достаточно терпелив и хорошо растёт в промежутке 5.5–7.5 pH. О показателе pH стоит беспокоиться только тогда, когда на носителе не прорастают споры или рост мицелия чрезвычайно замедлен (придется запастись лакмусовыми бумажками для оценки pH — прим. ред.).

Ниже приведены несколько формул сбалансированных питательных сред обогащённого агара, в высшей степени пригодных для выращивания мицелия видов Agaricus, Pleurotus, Lentinus, Stropharia, Lepisia, Flammulina, Volvariella, Panaeolus и Psilocybe. Из приведённых формул авторы предпочитают две: PDY (картофельный с декстрозой и дрожжами — Potato Dextrose Yeast) и MPG (зерновой с солодом и пептоном — Malt Peptone Grain) агаровые составы. Добавлением в любому составу молотой ржи или зернового экстракта можно добиться преобладающего роста нитевидного мицелия, т. е. наиболее предпочитаемого за его быстрый рост.

Выберите формулу, смешайте ингредиенты в сухом виде, поместите всё в мерную чашку и добавляйте воду пока не получите литр состава (дайте агару набухнуть перед стерилизацией — прим. ред.).

PDY (картофельный с декстрозой и дрожжами) агар

300 гр картофеля кипятить час в литре воды, отфильтровать

10 гр декстрозы (глюкозы)

2 0 гр дрожжей 2 0 гр агара

МЕА (агар на солодовом экстракте)

20 гр желто-коричневого солода 2 гр дрожжей (по усмотрению)

20 гр агара

(избегайте использования тёмного пивного карамелизованного солода, требуемый солод именно светлого, слегка подрумяненного цвета, более сыпучий и нелипкий)

MPG (агар зерновой с солодом и пептоном)

20 гр желто-коричневого солода 5 гр молотых зёрен ржи

5 гр пептона или неопептона

2 гр дрожжей (по усмотрению)

20 гр агара

(Прим. ред.: Если агар не удастся достать или купить, например, у китайцев, то можно попробовать взять цветной мармелад. Его следует измельчить и отмыть от всех пищевых добавок, выдерживая в воде несколько дней, периодически, несколько раз в день, меняя воду. Затем высушить.)

Для задерживания роста бактерий на каждый литр воды до стерилизации