Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2007 №5 - Федорочев Страница 68

Ответвления мультиспоровой культуры

Мультиспоровая культура это наименее сложный способ получения жизнеспособного мицелия, но не абсолютно чистого штамма. Прорастая в большом количестве, споры фактически создают множество штаммов, некоторые из которых несовместимы с другими, обладают разными потенциалами роста и нуждаются в различных условиях для плодоношения. Такая смесь штаммов подавляет рост более активных из них. В целом штаммы, полученные из спор, с большой вероятностью наследуют свойства своих предков. Если родители быстро захватывали субстрат и хорошо плодоносили в лабораторных условиях, то можно ожидать схожего поведения и от потомства. Культуры же, полученные от дикорастущих образцов, но испорченные в искусственных условиях, обычно плодоносят плохо. Как и в случае с дикорастущими растениями, штаммы дикорастущих грибов необходимо совершенствовать селекцией.

Из многих штаммов получаемых из спор некоторые могут быть способны только на вегетативный рост. Такой мицелий может усваивать питательные вещества, но не способен образовывать плодовые тела (следствие генеративного роста). Клеточная сеть, растущая из единственной споры, называется монокариотической. Монокариоты не способны к производству спорообразующих плодовых тел. При встрече и слиянии двух совместимых монокариотов происходит обмен цитоплазматическим и генным материалом. Полученный в результате дикариотический мицелий уже может производить плодовитое потомство. Сетеобразное объединение ветвей различных дикариотических штаммов называется анастомоз. Такая рекомбинация возможна на любой стадии выращивания мицелия: на агаре, зерне, или уже в бедном субстрате. Подобные пересечения грибных штаммов аналогичны созданию гибридов в садоводстве.

Другой способ создания культуры заключается в выделении отдельных спор разбавлением в объёме стерильной воды. Далее эта споровая взвесь разводится ещё большим количеством стерильной воды, которое уже в свою очередь и используется для инокуляции чашек с носителем. В этом случае культиватор получает возможность наблюдать за отдельными монокариотами и самостоятельно управлять процессами слияния для выведения высокоурожайных штаммов.

Грибоводы, нуждающиеся исключительно лишь в получении жизнеспособных культур, эту технику могут опустить, т. к. их должно полностью удовлетворить мультиспоровое разведение. Но для тех, кто заинтересован в скрещивании монокариотических штаммов и изучении характеристик получаемых таким образом культур, этот метод окажется бесценным. Помните, что из сотни спор прорастает в среднем от одной до пяти. Штаммы и генетика штаммов более детально обсуждаются в Главе XV.

Наибольшая опасность в приготовлении концентрированных мультиспоровых взвесей скрывается в увеличенной вероятности заражения, особенно бактериального. Некоторые бактерии паразитируют на клеточных оболочках мицелия, тогда как другие стимулируют прорастание спор для дальнейшего перемещения и медленного переваривания самого мицелия. Поэтому некоторые штаммы нездоровы изначально и обычно ассоциируются с высоким уровнем заражений. При попытке прорастить споры в очень большом количестве, те из них, что уже инфицированы, увеличивают вероятность распространения болезни на соседние.

Многие грибы, тем не менее, образуют уникальные симбиотические связи с другими микроорганизмами. Как ни удивительно, некоторые бактерии и дрожжи стимулируют развитие спор, которые в случае стерильной культуры было бы сложно прорастить. Споры Cantharellus cibarius, обычной и высоко ценимой лисички, не прорастали в искусственных условиях, противостоя усилиям лучших микологов мира. Но относительно недавно шведский миколог Nils Fries (1979) установил, что при добавлении в среду активированного угля и красных дрожжей (Rhodotorula glutinis (Fres.) Harrison) споры вскоре успешно прорастают. (Использование активированного угля рекомендуется для любых грибов с затруднённой всхожестью спор.)

Многие грибоводы сообщают, что определённые культуры пышно разрастаются при случайном заражении или намеренном внесении бактерий. Было установлено что Pseudomonas putida, Bacillus megaterium, Azotobacter vinelandii и некоторые другие микробы оказывают схожий эффект на различные виды грибов — и на прорастание спор, и на рост мицелия или образование плодовых тел. (Curto и Favelli, 1972; использование этих бактерий рассматривается в Приложении III). Однако большинство контаминантов с которыми приходится сталкиваться при разведении грибов, перенесены ли они воздушным путём или уже находились на спорах, делу не помогают. Из всех конкурентов наиболее пагубны бактерии. Прилежное соблюдение норм лабораторной гигиены, использование НЕРА-фильтров и правильные методы лабораторной работы призваны справится с этой напастью.

ПОЛУЧЕНИЕ КУЛЬТУРЫ ИЗ ЖИВОЙ ТКАНИ

Культура из ткани является гарантированным способом сохранения соответствующих генетических признаков конкретного гриба. Мицелий, полученный из ткани, в точности клонирует образец, тогда как мультиспоровая культура образует новый штамм. Ткань для клонирования гриба необходимо брать в течении 24–48 часов с момента сбора. Выделение чистой культуры вызовет затруднения, если образец уже пролежал несколько дней, слишком сухой или перезрелый. С другой стороны споры сохраняются в течение долгого времени.

Так как весь гриб состоит из уплотнённого мицелия, то жизнеспособную культуру можно получить из любой части плодового тела гриба. Шляпка, верхняя часть ножки и/или область где пластинки соединяются с нижней частью шляпки, являются лучшими местами для иссечения чистой ткани. Шляпку некоторых грибов покрывает кутикула. Сорвав эту тонкую кожицу также можно взять ткань из мякоти расположенной под ней. Протрите поверхность гриба ватным тампоном смоченным в спирте и удалите всю грязь и повреждённую внешнюю ткань.

Надломите шляпку или ножку гриба, обнажая его внутренние гифы.

Незамедлительно разогрейте скальпель докрасна и остудите его в чашке Петри со средой. Теперь надрежьте мякоть и извлеките маленький кусочек ткани гриба. Перенесите этот фрагмент ткани в центр чашки Петри с питательной средой как можно быстрее, избегая продолжительного контакта, как ткани так и агара с открытым воздухом. Повторите все действия и поместите культуру ещё в три или ещё лучше пять чашек. Пометьте каждую чашку видом гриба, датой, типом культуры (ткань) и разновидностью агаровой среды. При благоприятном стечении обстоятельств по прошествии от трёх до семи дней рост мицелия будет очевиден.

10 % — это общесредний уровень заражений, с которым грибовод может смириться (да, начинающий — прим. ред.). Тем не менее в первичных культурах, когда образцы берутся от диких видов, не будет чем-то необычным уровень контаминации в 25 %. Разнообразные и красочные заражения появляются обычно недалеко от точки пересадки на агар. Количество появившихся контаминантов зависит от чистоты образца ткани или спор, а также от гигиенический условий лаборатории. В культуре клонированной из ткани гриба чаще всего встречаются бактериальные заражения.

Заражение это факт жизни каждого грибовода. Контаминанты только тогда становятся проблемой, когда их количество увеличивается сверх всяких разумных пределов, что можно считать признаком грядущей катастрофы в лаборатории. Если пять, десять или даже пятнадцать процентов можно считать нормальным уровнем контаминации для любого культиватора, то резкий скачок без каких-либо видимых изменений в условиях поддержания гигиены может стать причиной для поисков новых способов борьбы.

Как только ткань покажет признаки роста, её следует переместить в другую чашку. Если нет явных признаков заражения, то быстрая пересадка не столь необходима. Если по соседству уже развивается плесень и