Коллектив авторов - Общая вирусология с основами таксономии вирусов позвоночных Страница 19

Транскрипция (+)РНК-геномов может протекать двумя путями:

а) с образованием субгеномных мРНК (необходимы для синтеза ранних белков);

б) без образования субгеномных мРНК. В этом случае транскрипция будет являться также и репликацией.

Субгеномные (+)РНК, так же, как и геномные, считываются с полноразмерной минус-нити. Это может происходить двумя способами.

В одном случае образуются субгеномные РНК (один или несколько видов), которые имеют 3'-концы, идентичные 3'-концу полноразмерной плюс-нити, но имеют разные 5'-последовательности. Это связано с тем, что минус-нити РНК имеют участки, подобные промоторам. РНК-полимераза узнает эти участки, связывается с ними и может начинать синтез РНК с них, а не только с 3'-конца. Таким способом образуются субгеномные РНК у альфавирусов и ряда вирусов растений, в том числе у ВТМ.

Другой вариант образования субгеномных РНК реализуется у коронавирусов. В зараженной клетке обнаруживаются 6 классов субгеномных РНК. Нуклеотидные последовательности этих РНК идентичны (+)РНК не только по 3'-, но и по 5'-концам. Объясняется это тем, что синтез всех плюс-нитей начинается на 3'-конце антигенома с синтеза так называемой лидерной последовательности (-70 нуклеотидов). Этот «лидер» обладает слабой связью с матрицей и может отсоединяться от нее, а затем присоединяться к другому участку в последовательности антигенома. Минус-матрица содержит 6 участков, комплементарных лидерной последовательности, что и определяет существование 6 классов субгеномных РНК.

концам. Объясняется это тем, что синтез всех плюс-нитей начинается на 3'-конце антигенома с синтеза так называемой лидерной последовательности (-70 нуклеотидов). Этот «лидер» обладает слабой связью с матрицей и может отсоединяться от нее, а затем присоединяться к другому участку в последовательности антигенома. Минус-матрица содержит 6 участков, комплементарных лидерной последовательности, что и определяет существование 6 классов субгеномных РНК.

2 (-)РНК-геномы. Геномная (-)РНК, нуклеотидная последовательность которой комплементарна мРНК, является матрицей для транскрипции и для репликации. Оба эти процесса протекают на матрице, находящейся в составе РНП, при участии вирионной РНК-полимеразы. Синтезируемые мРНК моноцистронны, так как все вирусы с (-)РНК геномом поражают только эукариот. (-)РНК геномы могут быть непрерывны, а могут быть сегментированы.

Механизм образования моноцистронных мРНК на матрице непрерывного ()РНК-генома до конца не установлен. Наиболее вероятной является модель, установленная для вируса везикулярного стоматита, согласно которой на границах между участками (-)РНК, кодирующими индивидуальные белки, располагаются специальные сигналы, терминирующие и реинициирующие цепи (+)РНК. Каждый такой участок, если идти от 3'– к 5'-концу, заканчивается 7-ю остатками уридиловой кислоты. На этом участке РНК-полимераза как бы пробуксовывает, синтезируя поли-А последовательность, состоящую из нескольких десятков адениловой кислоты. 5'концы молекул мРНК кэпируются, по всей вероятности, при участии вирусоспецифических ферментов.

Несколько иначе протекает транскрипция сегментированных (-)РНК геномов. Рассмотрим транскрипцию генома вируса гриппа, который представлен 8-ю сегментами (-)РНК. Транскрипция протекает в ядре в составе РНП. В качестве затравки для РНК-полимеразы используются фрагменты транскриптов клеточных мРНК. Вирусоспецифический белок (P-белок) узнает кэпированные 5'-концы этих транскриптов и фиксирует их на 3-конце геномных РНК. Затем этот же или другой белок вносит одноцепочечный разрыв на расстоянии 10-13 нуклеотидов от его 5'-конца. Возникающий при этом короткий кэпированный клеточный олигонуклеотид и является затравкой для синтеза вирусоспецифических мРНК. Поли-А последовательность на 3'-конце образуется за счет пробуксовывания полимеразы так же, как и у вируса везикулярного стоматита. Однако на этом особенности транскрипции генов вируса гриппа не заканчиваются. Два геномных сегмента вируса гриппа являются матрицей для синтеза четырех молекул мРНК, так как имеют альтернативные открытые рамки считывания, подобно ДНК-геномам. Два дополнительных вида мРНК образуются путем сплайсинга, осуществляемого клеточными ферментами по обычному механизму.

3 Диплоидный (+)РНК-геном ретровирусов. Прежде чем произойдет транскрипция ретровирусного генома, он претерпевает целый ряд молекулярных превращений, включающих обратную транскрипцию, интеграцию ДНК в геном хозяина и только после этого – синтез мРНК с использованием клеточного транскрипционного комплекса. Геном ретровирусов монолитен, кодирует полипротеин, то есть транскрибируется без образования субгеномных РНК. Первичные транскрипты подвергаются сплайсингу.

4 днРНК-геном реовирусов. Транскрипцию осуществляет вирионная транскриптаза – РНК-зависимая РНК-полимераза, находящаяся в составе однокапсидной вирусной частицы.

У сложно устроенных РНК-содержащих вирусов транскрипция происходит не на голой матрице, а в составе транскрипционных комплексов. Капсидные белки обеспечивают правильную конформацию РНК, защиту от клеточных нуклеаз, связь фрагментов генома друг с другом, а также регуляцию транскрипции.

5 Амбисенс (обоюдозначащая, амбиполярная) РНК. Амбиполярная РНК имеет 5'-конец позитивной полярности, а 3'-конец негативной полярности. При попадании в клетку с геномной РНК считываются два класса комплементарных РНК: с 3'-конца считывается субгеномная мРНК и полноразмерный антигеном. Антигеном, в свою очередь, опять служит матрицей для двух классов РНК. С антигенома считывается вторая субгеномная мРНК и полноразмерная обоюдозначащая геномная, которая идет на построение вирусных частиц.

3.7.2.3 Особенности транскрипции ДНК-геномов вирусов

Каждая клетка млекопитающих содержит приблизительно 6×109 пар азотистых оснований ДНК и > 104 активных промотора. Это создает определенные трудности для вирусной ДНК, т.к. вирусные промоторы должны эффективно конкурировать за использование клеточного транскрипционного аппарата, а завербованный аппарат клетки должен эффективно генерировать вирусные транскрипты. Для этого ДНК-вирусы осуществляют стратегию эффективного инициирования транскрипции на вирусной ДНК в одном или более специфическом промоторе вскоре после того, как ДНК введена в ядро.

Эти промоторы непосредственно управляют транскрипцией так называемых ранних генов.

Энхансеры (гены – усилители). Для того чтобы элементы клеточного транскрипционного аппарата могли взаимодействовать с ранними вирусными промоторами и активизировать транскрипцию, многие ДНК-вирусы содержат геныусилители или энхансеры – cis-acting регуляторные последовательности, выполняющие роль минимальных промоторов.

В отличие от промоторов, они могут активизировать транскрипцию, находясь выше или ниже сайта связывания, запускающего транскрипцию, со скоростью от тысячи пар азотистых оснований (биты) в секунду. Эта особенность определенных энхансеров подчеркивает конкурентоспособное преимущество к связыванию с вирусными промоторами. Действительно, высокая активность энхансера/промотора ранних генов цитомегаловируса определяет его частое использование в векторах экспрессии. Хотя клеточные гены часто содержат энхансеры, первый ген-усилитель был обнаружен у полиомавируса SV40. Энхансер SV40 состоит из двух тандемных дупликаций 72 п.н., которые содержат сайты связывания, по крайней мере, для шести различных факторов транскрипции, включая множественные сайты связывания для некоторых факторов. Необходимым условием для оптимальной функции энхансера является его специфическое местоположение и кратность факторов, участвующих в транскрипции.

Многие энхансеры также содержат специфические сайты для "архитектурных" белков, которые не имеют функции активации транскрипции, а образуют с энхансером собственный, скорее стереоспецифический, трехмерный комплекс белка и гена, который назван энхансеосомой. Эти комплексы нуклеопротеида могут активировать транскрипцию со значительной мощностью и специфичностью за счет взаимодействия с РНК-полимеразой II.

Факторы транскрипции вириона. В дополнение к энхансерам некоторые ДНК-вирусы кодируют белки, которые упакованы в вирион, вводятся в клетку с вирусной ДНК и, затем, облегчают транскрипцию ранних генов. Классическим примером этого являются поксвирусы, которые реплицируются в цитоплазме, что делает бесполезным клеточный аппарат транскрипции. Поксвирусы кодируют и упаковывают в вирионы собственную РНК-полимеразу, ферменты кэппирования и полиаденилирования и факторы транскрипции. После проникновения в клетку и раздевания, вирусный транскрипционный аппарат активируется и синтезирует вирусные ранние транскрипты. Другой примером является трансактиватор VP16 вируса простого герпеса (HSV). HSV VP16 синтезируется на поздней стадии инфекции и упаковывается в часть вириона, известную как тегумент, который находится между капсидом и оболочкой. После проникновения HSV в клетку, VP16 транспортируется в ядро, где формирует комплекс, по крайней мере, с двумя клеточными белками – Oct-1, который является активатором транскрипции, узнающим 8 п.н. последовательность ДНК, и HCF-1. Этот трехмерный комплекс связывается со специфической ДНКпоследовательностью HSV в области TAATGARAT (R = пурин), расположенной выше ранних генов. Специфичность и аффинное сродство обеспечивает Oct-1. Комплекс служит мощным активатором транскрипции. Эта функция связана с С- терминальным активационным доменом VP16, который может связываться фактически с любой последовательностью ДНК, расположенной выше TATA-бокса промотора, в связи с чем, он может активизировать транскрипцию в любой клетке эукариот. Действительно, VP16 является универсальным активатором транскрипции, т.к. активационный домен VP16 может взаимодействовать со многими различными белками клеточного аппарата транскрипции, однако не ясно, какой именно белок наиболее важен для его действия.