Коллектив авторов - Общая вирусология с основами таксономии вирусов позвоночных Страница 18

Реплицируются в ядре. Геном – двунитевая кольцевая сверхспирализованная ДНК размером 5-8 т.п.н., ассоциированная с 4-мя клеточными гистонами. Кодирует два неструктурных белка – большой и малый Т-АГ. Это трансформирующие антигены. Геном может интегрировать с геномом клетки хозяина. Большой Т-АГ обладает свойством хеликазы и принимает участие в репликации ДНК – связывается с ДНК в точке ori. Гены Т-АГ транскрибируются сразу после попадания ДНК в ядро. Т.о. транскрипция ДНК у этих вирусов опережает репликацию.

5 Репликация ДНК с использованием промежуточных конкатамерных форм. Простейшая схема такой репликации наблюдается у бактериофагов T-нечетной серии, например T7. ДНК фага T7 – линейная двухнитевая молекула с прямыми концевыми повторами. Инициация репликации начинается на внутреннем участке, где расположен промотор для фаговой ДНК-зависимой РНК-полимеразы, которая синтезирует транскрипт, использующийся в качестве затравки для синтеза ДНК. Внутренняя инициация проходит без разрыва родительской цепи. Возникшие две репликативные вилки движутся в разных направлениях, осуществляя полуконсервативную репликацию вирусного генома. Первая стадия этого процесса заканчивается образованием двух дочерних дуплексов, где вновь синтезированные нити не достроены, так как не произошло копирования 3'-концов родительских цепей, что неизбежно возникает при внутренней инициации на линейной матрице. Таким образом, один из 3'-концов образовавшихся дуплексов находится в однонитевой форме. Поскольку молекула ДНК фага Т7 имеет прямой концевой повтор, однонитевые 3'концы сестринских молекул взаимно комплементарны и способны к ассоциации. Ассоциация комплементарных последовательностей приводит к образованию димерных молекул – конкатемеров. Далее созревание молекул идет аналогично рассмотренному нами выше способу терминации. Фагоспецифический фермент вносит в димер ступенчатый разрыв таким образом, что выступающими становятся 5'концы, которые репарируются ДНК-полимеразой (рисунок 14).

Рисунок 14 – Схема репликации фага Т7

6 Репликация вирусных ДНК через обратную транскрипцию и интеграцию. Интеграция – внедрение вирусной (или другой) последовательности ДНК в геном клетки хозяина, приводящее к ковалентному соединению с хозяйской последовательностью. В таком случае репликация вирусного генома и его транскрипция осуществляются по общим клеточным механизмам.

Интеграция вирусного генома в геном хозяина может происходить несколькими путями:

a) интеграция с использованием сайт-специфической рекомбинации. В общем смысле рекомбинация – это взаимодействие между специфическими участками ДНК. Сайт-специфическая рекомбинация – взаимодействие между специфическими парами последовательностей, в пределах которых имеются гомологичные последовательности. Это консервативная рекомбинация. Например, при интеграции ДНК фага λ в рекомбинации участвуют два совершенно определенных участка вирусного и хозяйского геномов – attP и attB, соответственно. Эти участки имеют одинаковые сердцевины, но разные «плечи». Соответственно, фаговая последовательность обозначается как POP', клеточная – ВОВ'. В результате интеграции образуется участок ВОР'-РОВ'. Для осуществления интеграции необходима интеграза (топоизомераза I) и клеточный белок IHF (клеточный фактор интеграции). Интегрированный вирусный геном существует в виде профага и может выщепляться с участием вирусоспецифического белка;

б) интеграция и репликация в процессе репликативной транспозиции. Транспозон – последовательность ДНК, способная реплицироваться и внедрять одну из копий в новое место генома.

Явление репликативной транспозиции установлено для транспозирующего фага Mu. Геном фага – линейная днДНК, размером 30 т.п.н., имеет на концах клеточные, а не вирусные нуклеотидные последовательности, то есть всегда находится в состоянии профага. После попадания вируса в клетку, ДНК приобретает форму, близкую кольцевой, сближая концы. Вирус-специфический белок вносит однонитевые разрывы как в клеточные последовательности фаговой ДНК, так и в ДНК клетки-хозяина. Разрывы могут происходить практически в любом месте ДНК. Выступающие 5'-концы клеточной ДНК ковалентно соединяются с 3'-концами вирусной ДНК. Лишние концы удаляются, бреши репарируются и фаговый геном оказывается встроенным в геном клетки хозяина. Особенностью репликации фага Mu является то, что она идет без выщепления профага. Копии ДНК, образуемые в процессе репликации, эффективно внедряются в новые места ДНК хозяина.

3.7.2 Транскрипция

Транскрипция – первая стадия реализации генетической информации, на которой последовательность геномной нуклеиновой кислоты копируется в виде нуклеотидной последовательности мРНК. В основе механизма копирования лежит тот же структурный принцип комплементарного спаривания оснований, что и при матричном синтезе.

3.7.2.1 Основные принципы и механизмы транскрипции у вирусов

Транскрипция осуществляется ферментами РНК-полимеразами. В транскрипции ДНК-геномов вирусов принимает участие ДНК-зависимая РНК-полимераза II, в редких случаях – РНК-полимераза III. В транскрипции РНК-геномов участвует уникальный вирусный фермент РНК-зависимая РНК-полимераза.

Большинство ядерных ДНК-содержащих вирусов используют для транскрипции клеточную РНК-полимеразу II. Поксвирусы (цитоплазматические ДНК-содержащие вирусы) содержат свою ДНК-зависимую РНК-полимеразу, имеющую, тем не менее, сходство с РНК-полимеразой II. Часто вирусы бактерий для ранней транскрипции своих генов используют клеточную РНК-полимеразу II, а для поздней – собственную вновь синтезированную транскриптазу. В то же время, этот фермент может входить и в состав вириона.

В 1970 г. Балтимор с соавторами продемонстрировали наличие в составе вириона вируса везикулярного стоматита РНК-зависимой РНК-полимеразы. Позже этот фермент был найден у арена-, бунья-, орто- и парамиксо-, реовирусов, то есть у вирусов с (-)РНК и днРНК-геномом. У (+)РНК-содержащих вирусов РНК-полимераза детерминирована геномом. РНК-зависимые РНК-полимеразы обладают как транскриптазной, так и репликазной активностью.

Общие принципы транскрипции геномов вирусов сходны с таковыми для клеток про- и эукариот. Индивидуальные особенности проявляются на стадиях посттранскрипционного процессинга (созревания) мРНК и регуляции транскрипции. Синтез молекул РНК начинается в определенном месте матрицы, называемом промотором и заканчивается в определенном месте, называемом терминатором. Участок ДНК, ограниченный промотором и терминатором, представляет собой единицу транскрипции – транскриптон. В пределах транскриптона копируется только одна цепь, которую называют значащей или матричной. У эукариот в состав транскриптона входит один ген. Транскриптон прокариот содержит несколько генов, его чаще называют оперон. Транскрипционный цикл включает несколько стадий: связывание транскриптазы с матричной цепью, инициацию цепи РНК, элонгацию, терминацию и посттранскрипционный процессинг. Процессинг может включать кэпирование 5'конца, метилирование гуанидина, полиаденилирование 3'-конца, сплайсинг. При рассмотрении принципов транскрипции следует различать первичную транскрипцию (синтез на геномной матрице) и вторичную транскрипцию (синтез на вновь синтезированной матрице).

Многообразие видов вирусных геномов определяет существование различных подходов к синтезу вирусных мРНК в клетке хозяина. Однако все эти подходы могут быть суммированы в единой схеме стратегии синтеза мРНК (рисунок 15).

Рисунок 15 – Стратегия транскрипции геномов вирусов

3.7.2.2 Особенности транскрипции РНК-геномов вирусов

Независимо от структуры и стратегии репликации геномов, все вирусы должны экспрессировать гены на ранних этапах инфекции в виде функциональных мРНК, чтобы использовать трансляционный аппарат клетки для синтеза вирусных белков. Исходя из этого различные генетические стратегии, используемые РНК-вирусами, сосредоточены вокруг вирусных мРНК, которые определены, как ключевая структура в этих процессах. Транскрипция РНК-геномов вирусов осуществляется тем же ферментом, что и репликация – вирусоспецифической RdRp, которая также является транскриптазой. У РНК-содержащих вирусов репликация и транскрипция процессы взаимосвязанные и часто их трудно разделить.

1 (+)РНК-геномы. Геномная (+)РНК – это мРНК, то есть геномная нуклеотидная последовательность соответствует последовательности мРНК. Для осуществления процесса транскрипции вирусам с таким геномом необходимо синтезировать минус-нить с использованием РНК-зависимой РНК-полимеразы, которая чаще детерминирована вирусным геномом и транслируется непосредственно с геномной РНК. Вирусные (+)РНК-геномы не всегда кодируют полную РНК-полимеразу, возможно детерминирование только одной из субъединиц, которая затем ассоциирует с клеточными белками (фаг Qβ, некоторые вирусы растений).