Коллектив авторов - Общая вирусология с основами таксономии вирусов позвоночных Страница 17

Другие вирусы сами обеспечивают почти все белки репликативной вилки. Например, фаза элонгации при репликации ДНК аденовируса в условиях in vitro обеспечивается одной аденовирусной субъединицей ДНК-полимеразы, аденовирусным однонитевым ДНК-связывающим белком, который может увеличивать процессивность полимеразы, и клеточной топоизомеразой I или II. Это простота частично связана с необычным характером репликации ДНК аденовируса, в которой отсутствует синтез отстающей цепи.

Крупные ДНК-вирусы еще в большей степени обеспечивают себя ферментами репликации. Например, вирусы герпеса кодируют ДНК-полимеразу, фактор элонгации, праймазо-хеликазный комплекс, однонитевой ДНК-связывающий белок и, вероятно, еще ряд вирусных белков, которые не идентифицированы.

Терминация синтеза. В случае кольцевых геномов окончание синтеза и расхождение геномов упрощены, поскольку синтез дочерней цепи идет по кругу и в конце полного оборота в точке ori или при двунаправленной репликации в середине кольца 3’– и 5’-концы вновь синтезированной цепи совмещаются и лигируются. Попарно сцепленные кольца разъединяются топоизомеразой. В линейных ДНК, синтезированных с помощью РНК-затравок, все обстоит сложнее. Удаление РНК-праймера дает молекулу ДНК с выступающим 3’-концом и пробелом на 5’-конце. Предложено два способа завершения репликации с образованием полной копии матричной цепи: с использованием конкатамеров или через образование шпильки.

Основные схемы репликации ДНК-геномных вирусов.

1 Терминальная инициация с помощью самозатравочного механизма.

2 Терминальная инициация с помощью белок-нуклеотидной (Б-Н) затравки.

3 Механизм катящегося кольца.

4 Схема Кернса.

5 Репликация через интеграцию.

1 Репликация с использованием терминальной инициации при помощи самозатравочного механизма (рисунок 10). Такой тип репликации геномной ДНК имеют парвовирусы, у которых геном представлен линейной онДНК, имеющей на обоих конца самокомплементарные последовательности, формирующие шпилечные структуры. 3’-конец ДНК имеет уникальную последовательность размером 125 нуклеотидов, образующую двунитевую Т-образную шпилечную структуру, которая играет роль затравки для ДНК-полимеразы.

ДНК-полимераза в результате репарационного синтеза комплементарной цепи воссоздает дуплекс, обе цепи которого на одном конце ковалентно соединены. При этом 3’-концевой сегмент родительского генома в качестве матрицы не используется. Следовательно, полного воспроизведения вирусного генома пока не произошло. На следующем этапе вирусоспецифический фермент вносит разрыв в родительскую цепь на границе между реплицированным и нереплицированным участками последовательности (между 125 и 126 нуклеотидами).

Рисунок 10 – Схема первых этапов репликации однонитевой ДНК парвовирусов

Концевые 125 нуклеотидов родительского генома становятся условной частью вновь синтезированной цепи и возникший таким образом 3’-конец родительской цепи используется для ее регенерации. В результате этих реакций возникает дисперсная двунитевая репликативная форма вирусной ДНК (рисунок 10). Далее следует цепь реакций, включающих образование на одном из концов ДНК-затравки в виде «заячьих ушек», синтез новой цепи с вытеснением родительской, образование еще одной репликативной формы. Вторая репликативная форма ДНК используется в качестве матрицы для дальнейшего синтеза вирусной ДНК, а вытесненная из дуплекса однонитевая молекула или вступает в репликативный цикл или входит в состав дочерней вирусной частицы.

2 Репликация с использованием терминальной инициации при помощи белокнуклеотидной затравки (рисунок 11). Такой тип репликации геномной ДНК имеют аденовирусы, геном которых представлен линейной днДНК, имеющей на 5’-концах инвертированные повторы и ковалентно присоединенные геномные белки с м.м. 55 кДа.

В инфицированной аденовирусом клетке синтезируется вирусоспецифический белок массой 80 кДа, который связывается через серин с дезоксицитидином. Образовавшаяся структура Б-Ser – dCTP является затравкой, которая через цитозин комплементарно связывается с 3’-концевым гуанозином генома и инициирует синтез цепи ДНК.

Инициация может наблюдаться на любом конце родительской ДНК и может происходить или одновременно или последовательно. При последовательной инициации синтез дочерней цепи сопровождается вытеснением одной из родительских, а синтез комплементарной цепи идет на однонитевой матрице по репарационному механизму. В тоже время обсуждается и другой механизм синтеза второй нити. Замещенная родительская однонитевая ДНК имеет на концах самокомплементарные инвертированные повторы, которые отжигаются, восстанавливая двунитевую точку ori, узнаваемую инициирующими белками, обеспечивающими синтез родительскодочернего дуплекса. Таким образом, каждый родительский дуплекс копируется полуконсервативно.

Рисунок 11 – Схема репликации генома аденовируса

Однако процесс протекает без синтеза отстающей цепи, т.е. без образования множественных сайтов инициации и синтеза фрагментов Оказаки.

3 Репликация кольцевых геномов по механизму катящегося кольца (рисунок 12). Катящееся кольцо – способ репликации, при котором репликационная вилка совершает множество оборотов на кольцевой матрице. Синтезирующаяся в каждом цикле нить вытесняет прежнюю (гомологичную) цепь двуцепочечной молекулы, синтезированную в предыдущем цикле, образуя хвост, состоящий из набора последовательностей, комплементарных одноцепочечному матричному кольцу. В общих чертах репликация по механизму катящегося кольца имеет следующие стадии:

Рисунок 12 – Схема репликации ДНК-геномов по механизму катящегося кольца

1 Вирусоспецифический фермент вносит однонитевой разрыв в уникальном сайте родительской цепи репликативной формы.

2 Фермент остается связанным с 5’-концом, освободившийся 3’-концевой нуклеотид служит затравкой для ДНК-полимеразы.

3 ДНК-полимераза присоединяет нуклеотиды комплементарно замкнутой цепи, то есть синтезируется только лидирующая цепь. 5’-конец родительской цепи вытесняется. Наблюдается образование сигма-молекул (δ).

4 После того, как репликационная вилка завершит чуть больше полного оборота, вытесненная цепь замыкается в кольцо, а фермент перемещается на вновь синтезированную нить и цикл повторяется. Таким образом, вновь синтезированная нить, имеющая последовательность геномной, становится компонентом РФ, а предшествующая (родительская) оказывается в свободном виде.

Механизм катящегося кольца при репликации ДНК используют многие бактериофаги.

Однако этот механизм не игнорируют и вирусы эукариот. Например, линейная вирионная ДНК вируса герпеса при попадании в клетку переходит в кольцевую форму и, пройдя первую стадию тета-репликации (см. ниже), реализует механизм катящегося кольца.

Однако, вместо производства кольцевых дочерних молекул, репликация генерирует конкатамерные молекулы. Чтобы восстановить линейные дочерние молекулы ДНК вирусоспецифические белки расщепляют конкатамеры в определенных сайтах последовательности в процессе упаковки ДНК в капсиды.

4 Репликация ДНК по схеме Кернса (тета-репликация) включает несколько этапов (рисунок 13):

Рисунок 13 – Репликация ДНК по схеме Кернса

1) вирусоспецифический неструктурный белок, обладающий хеликазной активностью, связывается с ДНК-последовательностью в точке ori и расплетает двунитевую структуру;

2) праймаза синтезирует две РНК-затравки. Образуются две репликативные вилки (2 лидирующие и 2 отстающие цепи), которые в процессе комплементарного синтеза удаляются друг от друга, двигаясь в разных направлениях. Наблюдается образование тета-молекул (θ);

3) сбрасывание внутримолекулярного напряжения обеспечивает топоизомераза I путем внесения точечных однонитевых разрывов, которые тут же лигируются. Образуются два двунитевых кольца, где родительские цепи соединены друг с другом. Разъединение осуществляет топоизомераза II, которая вносит разрывы в двунитевые кольца. Затем разрывы лигируются. Такой тип репликации используют в качестве промежуточной стадии многие крупные ДНК-содержащие вирусы, в том числе: бактриофаги, вирусы герпеса, а также, вирусы с кольцевым днДНК геномом, поражающие человека и животных. Это вирусы, относящиеся к семействам Polyomaviridae (см. вирион SV40) и Papilomaviridae, ранее входившие в одно семейство Papovaviridae. Полиома- и папиломавирусы – это б/о, относительно мелкие (4555 нм) икосаэдрические вирусы. Капсид, образованный тремя белками, имеет четко выраженную капсомерную структуру (72 капсомера).

Реплицируются в ядре. Геном – двунитевая кольцевая сверхспирализованная ДНК размером 5-8 т.п.н., ассоциированная с 4-мя клеточными гистонами. Кодирует два неструктурных белка – большой и малый Т-АГ. Это трансформирующие антигены. Геном может интегрировать с геномом клетки хозяина. Большой Т-АГ обладает свойством хеликазы и принимает участие в репликации ДНК – связывается с ДНК в точке ori. Гены Т-АГ транскрибируются сразу после попадания ДНК в ядро. Т.о. транскрипция ДНК у этих вирусов опережает репликацию.