Алексей Сизенцов - Антибиотики и химиотерапевтические препараты Страница 17

а – помещение агарового блочка в центр стерильной чашки Петри; б – заливка чашки Петри стерильной агаризованной средой на 1,5 мм ниже уровня агарового блочка; 1 – агаровый блочек; 2 – агаровая среда, благоприятная для роста тест-организма.

Рисунок 8 – Схема приготовления чашек Петри для определения антибиотических свойств микроорганизмов, выросших на поверхности агарового блочка, находящегося в центре чашки (по Егорову, 1957)

После того как чашки подготовлены, изучаемый организм высевают микробиологической петлей на поверхность агарового блочка, и чашки помещают в термостат на срок, обеспечивающий нормальное развитие организма. Затем по радиусам агаровой пластинки высевают штрихами тест-организмы, и чашки вновь на 20-24 ч помещают в термостат.

Отсутствие роста штриха тест-микроба на том или ином расстоянии от блочка будет указывать на угнетение его антибиотическим веществом изучаемого организма. Если же штрих тест-микроба развивается в непосредственной близости от агарового блочка, то это означает, что данный организм устойчив к действию антибиотика изучаемого антагониста.

Для изучения актиномицетов рационально агаровые блочки того же диаметра вырезать из среды, на которой уже вырос актиномицет. Посев тестмикробов производят сразу же после внесения агаровой среды в чашку или же чашку предварительно помещают на 18-20 ч в термостат при 26-30 °C, с тем чтобы накопившийся в блочке антибиотик лучше продиффундировал в окружающий агар.

3.7.2 Определение антибиотической активности микроорганизмов при культивировании их в жидких питательных средах

При определении антибиотических свойств микроорганизмов, культивируемых в жидких средах, необходимо иметь в виду, что некоторые антибиотики в процессе развития микробов накапливаются внутри клеток продуцента, практически не выделяясь в окружающую среду. Поэтому определение антибиотических свойств организмов следует проводить как в культуральной жидкости, так и в экстрактах. Обычно для экстракции антибиотика из клеток продуцента применяют органические растворители (этиловый спирт, подкисленный этиловый спирт, ацетон и другие вещества).

Для оценки антибиотических свойств микроорганизмов, выросших в жидких средах, можно использовать метод последовательных разведении и метод бумажных дисков.

Метод бумажных дисков . На агаровую пластинку в чашке Петри высевают соответствующий тест-организм. Затем чашки с засеянным тест-микробом подсушивают в термостате при 37 °C в течение 20 мин. На одной чашке, т.е. в отношении одного тест-организма, может быть испытано одновременно 7 культуральных жидкостей.

Диски из фильтровальной бумаги диаметром 8 мм заготавливают впрок, стерилизуют в автоклаве под давлением выше нормального на одну атмосферу в течение 30 мин.

Стерильный диск фильтровальной бумаги захватывают стерильным пинцетом и смачивают в испытуемой культуральной жидкости, затем накладывают на поверхность питательного агара, засеянного тест-микробом. Чашку с тесторганизмом и бумажными дисками помещают в термостат при температуре, оптимальной для роста тест-организма, на 24 ч, если это бактериальные формы тест-микроба, и на промежуток времени от 48 до 72 ч для грибных или дрожжеподобных форм.

При наличии антибиотического вещества в испытуемой культуральной жидкости вокруг диска образуется зона задержки роста тест-микроба.

Приведенные методы пригодны для определения антибиотической активности микроорганизмов только в отношении бактерии, актиномицетов, дрожжевых и дрожжеподобных организмов и грибов. Для выяснения антивирусного или антиопухолевого действия организмов в силу специфичности этих объектов используют другие методы, описанные в 3.7.3, 3.7.4.

3.7.3 Определение антивирусного действия антибиотиков

Вирусы – внутриклеточные паразиты и поэтому не могут развиваться в виде «чистой культуры» вне клеток своего хозяина. Это обстоятельство и заставляет применять другие методы первоначального отбора активных веществ, отвечающие особенностям развития вирусов.

Метод тканевых культур . Существует несколько вариантов метода тканевых культур, но наиболее удобен метод использования переживающих кусочков хорион-аллантоисной ткани куриного эмбриона в модификации Тама, Фалкерса и Хорсфолла (1953).

Из верхней части куриного яйца с 10-11-дневным эмбрионом вырезают стерильными ножницами шесть кусочков скорлупы с прилегающей к ней тканью хорион-аллантоисной оболочки. Кусочки ткани осторожно отделяют от скорлупы и промывают буферным раствором. Каждый такой кусочек ткани помещают в пробирку с 1 мл среды следующего состава, в процентах (%): NaCl – 0,68, KCl – 0,04, CaCl2 – 0,02, MgSO4 – 0,01, NaH2PO4 – 0,0125, NaHCO3 – 0,22, глюкоза – 1,0.

Кроме того, в каждую пробирку добавляют пенициллин (100 ед/мл), с тем чтобы предохранить ткань от загрязнения (развития микроорганизмов). Пробирки устанавливают в специальный медленно (около 12 об/ч) вращающийся барабан.

Для выяснения антивирусного действия продуктов жизнедеятельности определенного организма кусочки ткани заражают соответствующим видом вирусов и вносят в пробирки, содержащие культуральную жидкость (при рН 7,0) исследуемого организма. Пробирки помещают в барабан на 48 ч.

Если культуральная жидкость обладает антивирусным действием, то в среде, окружающей ткань, не будет обнаружено вируса. При отсутствии антивирусного действия вирусы будут интенсивно размножаться в клетках ткани, что может быть легко обнаружено методом титрования на эритроцитах.

Метод оценки антивирусных свойств культуральных жидкостей различных микроорганизмов прост, удобен и позволяет сравнительно быстро получить необходимый ответ при массовых испытаниях.

Метод с использованием листьев растений разработан для выяснения антивирусного действия антибиотиков по отношению к вирусу табачной мозаики.

Микроорганизм выращивают на агаровой пластинке в чашке Петри. После достаточно хорошего развития микроба из агара вырезают блочки, которые затем прикрепляют с помощью расплавленной желатины к листьям дурмана, предварительно зараженным вирусом табачной мозаики. Для предохранения от инфекции к желатину добавляют пенициллин. Листья дурмана с агаровыми блочками помещают на несколько дней во влажные камеры. В течение этого периода поверхность листа дурмана покрывается очагами некроза. Но если находящееся в агаровом блочке антибиотическое вещество, образуемое изучаемым организмом, подавляет развитие вируса, то вокруг такого блочка не будет некротических образований, т.е. поверхность листа в зоне действия антибиотиков будет свободной от поражения вирусом табачной мозаики (рисунок 9).

1 – очаги некроза, вызванные вирусом табачной мозаики; 2 – наличие противовирусного действия; 3 – отсутствие действия на вирусы.

Рисунок 9 – Использование листьев дурмана для определения антивирусного действия антибиотиков (по Шорину и др., 1956)

Для окончательной оценки противовирусного действия антибиотических препаратов необходимо использовать животных (чаще всего мышей) или куриные эмбрионы, зараженные вирусами.

3.7.4 Определение противофаговой активности

Бактерио- и актинофаги – это вирусы микроорганизмов, обладающие рядом свойств, общих с вирусами растений и животных. Определение противофаговой активности микроорганизмов основано на тех же принципах, что и определение противобактериальных свойств организмов.

Культуру, изучаемую на антифаговые свойства, высевают на агаровую или в жидкую среду, благоприятную для образования антибиотического вещества. В качестве тест-объекта используют смесь бактерий и специфического для этой бактерии фага.

При использовании одного из диффузионных методов (метода агаровых блочков, лунок в толще агаровой пластинки, штрихов и т. д.) наблюдается следующая картина. Если антибиотическое вещество подавляет рост фага, то в зоне диффузии антибиотика будет происходить рост используемой бактерии, на остальной же поверхности агаровой пластинки под действием развивающегося фага бактерии будут лизироваться, и поверхность пластинки останется чистой.

Если же под действием изучаемого биологически активного вещества не произойдет развития бактерий и в зоне его диффузии, то это может означать, что используемый в опытах организм не образует противофагового вещества или же образуемое антибиотическое вещество подавляет развитие, как фага, так и бактерии. Последнее легко проверить, если в качестве тест-организма взять только бактерию. Противовирусным действием обладает ряд антибиотических веществ, таких как эрлихин, луридин, фумагиллин, гелиомицин, вирусин и др.

3.7.5 Определение противоракового действия антибиотиков