Алексей Сизенцов - Антибиотики и химиотерапевтические препараты Страница 18

3.7.5 Определение противоракового действия антибиотиков

Не всегда антираковое действие препарата совпадает с антибактериальным или антигрибным действием. Поэтому для определения противораковой активности культуральных жидкостей или очищенных препаратов в качестве тест-объектов используют непосредственно раковые клетки. С этой целью применяют методы, основанные на использовании экспериментальных животных, культуры тканей или свободноплавающих в отдельных полостях организма опухолевых клеток (асцитные клетки), окончательная оценка антиопухолевого действия испытуемого вещества проводится в опытах на животных.

Методы с использованием экспериментальных животных . В качестве тест-объекта используются клетки асцитного рака Эрлиха у мышей (клетки находятся в виде взвеси в асцитической жидкости животных). Взвесь асцитных раковых клеток смешивается с равным объемом изучаемого антибиотического препарата и смесь помещается в рефрижератор при 4 °C на четыре часа, после чего ее подкожно прививают мышам.

Для контрольных животных вместо исследуемого препарата используется физиологический раствор. Через 10 дней мышей убивают и определяют наличие опухолей и их размеры. Если изучаемый препарат убивает асцитные раковые клетки, то они, естественно, не дадут образования опухолей.

Тест-объектом могут служить не только клетки асцитного рака Эрлиха, но и других опухолей, полученных экспериментальным путем у мышей и крыс. Использование клеток различных опухолей связано с необходимостью более широкого изучения противоопухолевого действия исследуемых препаратов, для более точного определения значения изучаемой культуральной жидкости или антибиотика в отношении их действия на раковые клетки.

Прежде чем использовать опухоль в качестве тест-материала, необходимо из опухолевых тканей получить тонкую взвесь. С этой целью в стерильных условиях вылущивают опухоль, тщательно, очищают от некротических участков и несколько раз промывают стерильным физиологическим раствором. После этого отобранные в чашки Петри кусочки опухоли измельчают ножницами до получения гомогенной кашицы и разводят примерно в 2 раза стерильным физиологическим раствором. После тщательного размешивания взвесь фильтруют через 2 слоя стерильной марли. Затем определяют количество опухолевых частиц, содержащихся в 1 мм взвеси (подсчет проводят в камере Горяева). Если при подсчете оказывается, что количество частиц в 1 мм3 незначительно, то полученную взвесь концентрируют методом центрифугирования. Надосадочную жидкость отсасывают, а опухолевые клетки, осевшие на дно пробирки, разводят нужным объемом стерильного физиологического раствора.

В дальнейшем постановка опыта со взвесью опухолевых клеток, приготовленной из опухоли животных, такая же, как и с клетками асцитного рака Эрлиха. Различие лишь в некотором удлинении срока наблюдения (до 12 дней).

Чашечный метод . Данный метод служит для определения действия изучаемых антибиотических препаратов на раковые клетки. Тест-объектом служат клетки асцитного рака, которые смешиваются с теплой агаровой средой (пептон, глюкоза, плазма крови) и разливаются в чашки Петри. На застывшую агаровую пластинку, содержащую клетки асцитного рака, накладывают агаровые блочки с выросшей культурой микроорганизма или диски фильтровальной бумаги, предварительно смоченные культуральной жидкостью или раствором очищенного препарата. Чашки помещают в холодильник на несколько часов для диффузии изучаемых веществ в толщу агара, содержащего асцитные раковые клетки. После этого чашки помещают в термостат при 37 °C на несколько часов и затем, вынув их из термостата, освобождают от агаровых блочков или дисков фильтровальной бумаги. Поверхность агаровых пластинок заливают 0,05 %-ным раствором метиленового синего. Чашки покрывают стеклянными пластинками, помещают в термостат на несколько часов. Если изучаемые препараты убивают клетки асцитного рака, то на месте агаровых блочков или дисков фильтровальной бумаги появятся голубые зоны. Свойство обесцвечивать метиленовый синий, т.е. превращать его в лейкосоединение, связано с выделением живыми асцитными клетками ферментов дегидраз. При отсутствии действия антибиотика на раковые клетки асцитного рака вся поверхность агаровой пластинки будет бесцветной так как убитые клетки не выделяют дегидразы и метиловый синий не обесцвечивается.

Способностью восстанавливать метиленовый синий обладают взвеси клеток различных опухолей животных и человека. Однако в случае использования взвеси клеток солидных опухолей их количество в 1 мл взвеси, необходимое для восстановления метиленового синего, различно (таблица 5).

Приведенные данные показывают, что пользуясь чашечным методом вполне возможно вести отбор противораковых веществ на раковых клетках человека, так как взвеси последних, как и. клетки асцитного рака, восстанавливают метиленовый синий.

Следует отметить, что дегидразная активность раковых клеток может обнаруживаться не только с помощью метиленового синего, но и с помощью ряда других веществ, например 2,6-дихлорфе-нолиндофенола, солей тетразола.

Препараты, подавляющие или тормозящие рост опухоли, обычно подавляют и дегидразную активность соответствующей опухоли.

Таблица 5 – Количество клеток различных опухолей животных и человека, необходимое для восстановления метиленового синего (по Талызиной, 1960)

Пробирочный метод . В качестве определенной модификации чашечного метода является метод испытания противораковой активности антибиотиков в пробирках. Метод состоит в том, что в стандартные пробирки вносят по 0,5 мл испытуемой культуральной жидкости и взвеси клеток асцитного рака Эрлиха (конечная концентрация клеток в 1 мл 500000), затем добавляют 2 мл расплавленной агаровой среды, содержащей метиленовый синий. В контрольные пробирки вместо испытуемой культуральной жидкости добавляют 0,5 мл среды, на которой выращивается изучаемый организм. После перемешивания пробирки помещают на 3-4 ч в термостат при 36-37 °С.

Если содержимое пробирок окрашивается метиленовым синим, то это указывает на то, что испытуемый препарат подавляет дегидразную активность клеток асцитного рака.

Преимущество пробирочного метода по сравнению с чашечным в том, что при этом происходит непосредственный контакт антибиотика с асцитными клетками Эрлиха независимо от степени диффузии изучаемого препарата в агар.

Использование микроорганизмов при изыскании противораковых антибиотиков. Обмен веществ в опухолевых клетках отличается от обмена нормальных клеток; различие, в частности, определяется интенсивностью дыхания, так в опухолевых клетках оно значительно снижено. Исходя из этого, высказано предположение о возможности использования мутантов микроорганизмов, имеющих пониженный коэффициент дыхания, в качестве тест-объектов для поисков противораковых антибиотиков.

В результате ультрафиолетового облучения и действия уретана удалось получить мутанты стафилококков, бактерий кишечной группы и других организмов с пониженным коэффициентом окисления. Поглощение кислорода у таких микроорганизмов может составлять от 20 % до 80 % по сравнению с дыханием исходных родительских культур. В качестве тест-организмов для определения антиопухолевого действия культуральных жидкостей микроорганизмов можно также применять мутанты дрожжевых организмов с пониженным коэффициентом дыхания.

Сравнивая чувствительность метода с использованием асцитных клеток Эрлиха и метода с биохимическими мутантами микроорганизмов, следует заключить, что биохимические мутанты – более чувствительные тесты при определении противоопухолевого действия микроорганизмов.

Использование опухолевых клеток, выращенных in vitro, для отбора организмов, образующих противоопухолевые антибиотики. В последнее время оказалось возможным культивировать некоторые опухолевые клетки в искусственных условиях (in vitro) подобно тому, как это осуществляется в отношении микроорганизмов. Лейкемические клетки мышей могут расти и размножаться в среде, содержащей пептон, диализированную лошадиную сыворотку и фолиевую кислоту (10 мкг/мл). Это позволяет использовать перевиваемые штаммы клеток рака человека для изучения противоопухолевого действия некоторых антибиотиков. С этой целью клетки перевиваемых штаммов выращивают в матрацах на специальной среде с добавлением 10 % телячьей сыворотки. Культивирование проводят при 36 °С. Через 6-7 суток среду удаляют и слой клеток снимают с поверхности стекла 0,02 %-ным раствором этилендиаминтетрауксусной кислоты. Через 15-20 мин инкубации в термостате клетки переходят в суспензию.

Способность некоторых опухолевых клеток размножаться в пробирках позволяет применять их в качестве тест-объекта при поиске, выделении и очистке новых антибиотических веществ, обладающих противоопухолевой активностью.